急性缺血性腦卒中病人血漿miR-141、PAPP-A水平與疾病嚴重程度和短期轉歸的關系

劉曉琳，朱艷玲，郭麗莎，郝文莉

急性缺血性腦卒中(acute ischemic stroke，AIS)是最常見的腦卒中類型，發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，占我國腦卒中的69.6%～70.8%[1]。臨床對急性腦卒中病人轉歸結局的判斷主要依據(jù)影像學結果和臨床經(jīng)驗，而對血糖等血液生化指標外的生物標志物研究較少。microRNAs(miRNAs)具有重要的生物學功能，參與生長發(fā)育、細胞增殖、細胞分化等，目前已發(fā)現(xiàn)多種miRNAs與AIS病人預后有關[2]。有研究表明，miR-141在膠質瘤癌組織及細胞系中高表達，與腫瘤大小、分化程度及是否轉移相關[3]。妊娠相關血漿蛋白A(pregnancy-associated plasma protein A，PAPP-A)作為金屬蛋白鋅家族中的成員之一，可減少纖維蛋白的溶解，促進凝血過程，進一步使內皮細胞外基質重塑，加速斑塊的不穩(wěn)定[4]。研究表明，PAPP-A在AIS病人血漿中高表達，可作為腦卒中的預測因子及預后指標[5]。但miR-141與PAPP-A在AIS病人血漿中的表達及與預后的關系尚不清楚。本研究對miR-141、PAPP-A在AIS病人血漿的表達情況進行檢測，并探討二者與AIS病人腦卒中嚴重程度和短期轉歸的相關性，現(xiàn)報道如下。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選取2018年12月—2019年12月在我院神經(jīng)內科住院的AIS病人183例，其中，男99例，女84例；年齡50～79(62.30±9.20)歲。納入標準：①符合中國急性缺血性腦卒中診治指南(2018)中診斷標準[1]；②經(jīng)1.5T或3.0T磁共振成像(MRI)診斷證實；③病人臨床資料完整。排除標準：①伴有嚴重心、肝、腎功能異?；驉盒阅[瘤者；②入院前1個月內有嚴重感染或近期(發(fā)病前2周內)有手術和創(chuàng)傷史；③出血性腦血管病或短暫性腦缺血發(fā)作；④接受靜脈溶栓以及血管內治療或免疫抑制劑治療等；⑤臨床資料不全者。依據(jù)美國國立衛(wèi)生研究院卒中量表(National Institutes of Health Stroke Scale，NIHSS)[6-7]評分，將病人分為輕度卒中組(NIHSS評分≤8分，115例)及中重度卒中組(NIHSS評分>8分，68例)。腦卒中后14 d采用改良Rankin量表(Modified Rankin Scale，mRS)[8]評分標準進行評分，mRS 評分0～2分為轉歸良好，mRS評分3～5分或死亡為轉歸不良。

1.2 主要試劑與儀器 RNA提取試劑盒購自北京天根生化有限公司；實時熒光定量試劑盒購自大連TAKARA公司；反轉錄試劑盒購自日本TOYOBO公司，miR-141及U6引物，由上海生工生物公司設計與合成；實時熒光定量聚合酶鏈式反應(qRT-PCR)儀購自美國Bio-Rad公司；PAPP-A檢測試劑盒購自江蘇晶美生物科技有限公司。

1.3 研究方法

1.3.1 樣品采集及保存 血漿樣品：采集AIS病人空腹靜脈血5 mL，裝入乙二胺四乙酸二鈉(EDTA-2Na)抗凝管，常溫3 000×g離心10 min后收集血漿，-80 ℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 qRT-PCR檢測血漿中miR-141的表達 按照RNA提取試劑盒方法、步驟抽提血漿中的總RNA，按照反轉錄試劑盒(日本 TOYOBO)說明書進行反轉錄合成cDNA。miR-141基因和U6基因序列設計引物，由上海生物工程公司合成，引物序列見表1，反應總體系20 μL。反應條件：95 ℃、90 s，95 ℃、30 s，65 ℃、30 s，72 ℃、15 s，38個循環(huán)。每個樣品設置3個復孔。反應結束后，以U6作為內參，采用2-??CT分析法計算miR-141表達水平。

表1 qRT-PCR引物序列

1.3.3 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測血漿PAPP-A水平 采用ELISA法檢測血漿PAPP-A水平，操作步驟嚴格按照試劑盒說明書進行。

2 結 果

2.1 輕度卒中組與中重度卒中組臨床資料比較 輕度卒中組高血壓、冠心病、空腹血糖、C反應蛋白、miR-141、PAPP-A水平與中重度卒中組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表2。

表2 輕度卒中組與中重度卒中組臨床資料比較

2.2 Logistic回歸分析AIS嚴重程度的影響因素 將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的變量作為自變量，腦卒中嚴重程度作為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示，miR-141、PAPP-A、高血壓、冠心病、空腹血糖和C反應蛋白是腦卒中嚴重程度的影響因素(P<0.05)。詳見表3。

表3 AIS嚴重程度影響因素的Logistic回歸分析

2.3 轉歸良好組與轉歸不良組臨床資料比較 轉歸良好組糖尿病、冠心病、收縮壓、空腹血糖、C反應蛋白、miR-141、PAPP-A水平及基線NIHSS評分與轉歸不良組比較，差異均有統(tǒng)計學意義(P<0.05)。詳見表4。

表4 轉歸良好組與轉歸不良組臨床資料比較

2.4 Logistic回歸分析AIS病人短期轉歸的影響因素 將單因素分析中差異有統(tǒng)計學意義的變量作為自變量，病人短期轉歸情況作為因變量進行Logistic回歸分析，結果顯示，miR-141、PAPP-A、糖尿病、冠心病、空腹血糖、C反應蛋白和基線NIHSS評分是短期轉歸不良的影響因素(P<0.05)。詳見表5。

表5 短期轉歸不良危險因素的Logistic回歸分析

3 討 論

缺血性腦卒中為神經(jīng)內科常見疾病，是中老年人最常見的腦血管疾病之一，臨床表現(xiàn)以神經(jīng)功能缺損為主，具有高發(fā)率、高死亡率、高致殘率和高復發(fā)率等特點[9-10]。因此，尋找影響疾病嚴重程度并識別預后不良的危險因素，對腦卒中的預防和治療尤為重要。

miRNA與腦組織發(fā)育、分化、生理功能及病變等密切相關，可參與炎癥、促血管形成過程或抑制內皮細胞增殖來發(fā)揮抗血管形成等多種與缺血性腦卒中相關的作用。Aconetti等[11]研究表明miR-23b在頸動脈球囊血管損傷大鼠中下調表達，過表達miR-23b可減少內膜增生，調節(jié)血管損傷后血管平滑肌細胞的表型轉換。侯麗淳等[12]研究表明缺血性腦卒中病人血漿中miRNA-145表達水平升高、miRNA-146a表達水平降低，與缺血性腦卒中的發(fā)生和發(fā)展密切相關。劉大全等[13]研究表明miR-141能通過增強血管內皮細胞的增殖和遷移能力，進而促進血管新生。Liu等[14]利用缺氧處理大鼠腸系膜上動脈和血管平滑肌細胞，結果發(fā)現(xiàn)miR-141可參與缺氧和出血后血管反應活性的調控。本研究顯示，與輕度卒中組比較，中重度卒中組血漿miR-141表達水平明顯降低，Logistic回歸分析顯示miR-141與AIS嚴重程度有關，miR-141水平降低是轉歸不良的獨立危險因素，推測低水平miR-141可能對血管新生的促進作用較弱，不利于病人轉歸。

PAPP-A是金屬蛋白鋅家族中的成員之一，在炎性反應過程中可導致斑塊破裂，引發(fā)腦梗死，其水平升高可反映動脈粥樣硬化斑塊的不穩(wěn)定性[10，15]。Wang等[16]研究表明PAPP-A在缺血性腦卒中病人血漿高表達，與缺血性腦卒中的嚴重程度或預后相關。生曉娜等[17]研究表明在急性缺血性腦血管病病人中，頸動脈粥樣硬化斑塊形成者血漿PAPP-A水平升高，與急性缺血性腦血管病病人頸動脈粥樣硬化的發(fā)生和進展有關。Zhang等[18]研究表明，miR141可通過作用于PAPP-A，抑制氧化型低密度脂蛋白誘導的動脈粥樣硬化血管平滑肌細胞的增殖。本研究結果顯示，中重度卒中組血漿PAPP-A水平明顯高于輕度卒中組，Logistic回歸分析提示，血漿PAPP-A水平與AIS嚴重程度相關，推測PAPP-A水平高可能影響血管流通性，進而影響AIS嚴重程度。轉歸不良組PAPP-A水平明顯高于轉歸良好組，PAPP-A水平增高是轉歸不良的獨立危險因素，提示PAPP-A可能作為AIS病人潛在預后標志物。

綜上所述，AIS病人血漿中miR-141低表達、PAPP-A高表達，二者與腦卒中嚴重程度和短期轉歸有關，可能作為AIS病人潛在的預后標志物。但由于本研究樣本量有限，仍需擴大樣本量做進一步研究。