105例皮肌炎/多發(fā)性肌炎/腫瘤相關(guān)性肌炎臨床特征和外周血淋巴細(xì)胞亞群特點(diǎn)

張盼娣，李 芳

特發(fā)性炎癥性肌病(idiopathic inflammatory myopathy，IIMs)是一組以骨骼肌和皮膚慢性炎癥為特征的易質(zhì)性、自身免疫性疾病，伴有近端對(duì)稱性肌無力、血清肌酶升高以及特定的皮膚病變和肌肉外表現(xiàn)[1-2]，包括皮肌炎(dermatomyositis，DM)、多發(fā)性肌炎(polymyositis，PM)、包涵體肌炎(inclusion body myositis，IBM)、非特異性肌炎(nonspecific myositis，NSM)和免疫介導(dǎo)的壞死性肌病(immune-mediated necrotizing myopathy，IMNM)等。其中，伴有腫瘤的肌炎常被稱為腫瘤相關(guān)性肌炎(cancer associated myositis，CAM)，通常定義為在診斷肌炎前后3年內(nèi)發(fā)生腫瘤的病人[3]，以DM、PM多發(fā)。目前IIMs的致病機(jī)制尚未明確，多數(shù)認(rèn)為是遺傳易感個(gè)體在感染與非感染因素誘導(dǎo)下由免疫介導(dǎo)的疾病。DM通常被認(rèn)為是CD4+T細(xì)胞驅(qū)動(dòng)的疾病，PM可能為CD8+T細(xì)胞介導(dǎo)的自身免疫過程[4]，而CAM大多數(shù)被認(rèn)為具有副腫瘤性質(zhì)[5]。研究發(fā)現(xiàn)IIMs病人的肌肉組織有免疫細(xì)胞浸潤(rùn)和促炎細(xì)胞因子的表達(dá)，表明免疫失衡在IIMs的發(fā)病中起重要作用。本研究收集105例DM、PM、CAM病人的一般信息、臨床及實(shí)驗(yàn)室等資料，分析3組病人的臨床特征與外周血淋巴細(xì)胞亞群等實(shí)驗(yàn)室相關(guān)指標(biāo)，明確疾病發(fā)生可能參與的免疫細(xì)胞，探討潛在的致病機(jī)制，以利于臨床早期診治。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象 選取2017年12月—2019年6月就診于山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院風(fēng)濕免疫科的住院病人105例為病例組，均符合1975年Bohan/Peter提出的診斷標(biāo)準(zhǔn)。其中，DM病人56例，男21例，女35例；年齡26～78(49.71±13.12)歲；病程6.00(2.00，24.00)個(gè)月；PM病人24例，男11例，女13例；年齡31～76(48.17±12.21)歲；病程30.00(2.00，93.00)個(gè)月；CAM病人25例，男9例，女16例；年齡28～76(59.44±8.49)歲；病程7.50(2.00，51.00)個(gè)月。所有病人臨床及實(shí)驗(yàn)室資料完整。排除標(biāo)準(zhǔn)：合并各種急慢性感染、甲狀腺功能減退或伴其他傳染性疾病者；重疊其他風(fēng)濕免疫系統(tǒng)疾病者。同期選取我院體檢中心的健康體檢者103名為健康對(duì)照組，男62名，女41名，年齡20～78(45.81±13.41)歲，無風(fēng)濕免疫病史及家族史。本研究通過山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)，所有病人均簽署知情同意書。

1.2 研究方法

1.2.1 資料收集 收集所有病人的一般資料(性別、年齡、病程)；臨床特征(肌痛、肌無力、肺間質(zhì)病變、關(guān)節(jié)痛、雷諾現(xiàn)象)及自身抗體(抗ANA抗體、抗Jo-1抗體、抗Mi-2抗體、抗SRP抗體、抗Ro-52抗體)；實(shí)驗(yàn)室資料[紅細(xì)胞沉降率(ESR)、C反應(yīng)蛋白(CRP)、丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(ALT)、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶(AST)、肌酸激酶(CK)、肌酸激酶同工酶(CK-MB)、乳酸脫氫酶(LDH)、α-羥丁酸脫氫酶(HBDH)]。其中，ESR采用魏氏法檢測(cè)，CRP、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH采用全自動(dòng)生化分析儀檢測(cè)。

1.2.2 CD4+T淋巴細(xì)胞亞群的測(cè)定 ①Th1、Th2、Th17細(xì)胞培養(yǎng)與標(biāo)記：取80 μL抗凝血分別加入刺激劑10 μL PMA工作液(終濃度30 ng/mL)、10 μL Ionomycin工作液(終濃度750 ng/mL)和1 μL GolgiStop，37 ℃二氧化碳(CO2)培養(yǎng)箱刺激5 h。將細(xì)胞分成兩管，A管和B管均加入抗人CD4-FITC，室溫避光孵育30 min后，各管分別加入新鮮配制的Fixation/Permeabilization液1 mL渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min后，A管加入白細(xì)胞介素(IL)-4-PE和γ干擾素(IFN-γ)-抗原遞呈細(xì)胞(APC)，B管加入抗人IL-17-PE，室溫避光孵育30 min后，磷酸緩沖鹽溶液(PBS)洗滌，上機(jī)檢測(cè)。②調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)標(biāo)記：取80 μL抗凝血加入CD4-FITC和CD25-APC，室溫避光孵育30 min后，各管分別加入新鮮配制的Fixation/Permeabilization液1 mL渦旋混勻，4 ℃避光孵育30 min后，加入抗人叉頭蛋白P3(FOXP3)抗體，室溫避光孵育30 min后，PBS洗滌后，上機(jī)檢測(cè)。③流式細(xì)胞儀測(cè)定：24 h內(nèi)上流式細(xì)胞儀(Calibur，BD，USA)測(cè)定分析結(jié)果。根據(jù)前向角散射光(FSC)對(duì)側(cè)向角散色光(SSC)的散點(diǎn)圖對(duì)淋巴細(xì)胞設(shè)門區(qū)分淋巴細(xì)胞，以CD4對(duì)SSC設(shè)門區(qū)分Th細(xì)胞(CD4+)，取門內(nèi)1×104個(gè)細(xì)胞，以CellQuest軟件獲取、分析相對(duì)百分?jǐn)?shù)。

2 結(jié) 果

2.1 各組一般資料比較 CAM組發(fā)病年齡高于DM組、PM組及健康對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；各組性別、病程比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表1。

表1 各組一般資料比較

2.2 3組病人臨床特點(diǎn)及自身抗體比較 3組病人肌痛、肌無力、關(guān)節(jié)痛、抗ANA抗體、抗Mi-2抗體、抗SRP抗體及抗Ro-52抗體比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CAM組肺間質(zhì)病變、雷諾現(xiàn)象及抗Jo-1抗體陽性發(fā)生率低于DM組、PM組(P<0.05)；DM組肺間質(zhì)病變發(fā)生率高于PM組(P<0.05)，而雷諾現(xiàn)象、抗Jo-1抗體陽性發(fā)生率與PM組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表2、表3。

表2 3組病人臨床特點(diǎn)比較 單位：例(%)

表3 3組病人自身抗體比較 單位：例(%)

2.3 實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較

2.3.1 3組病人炎性指標(biāo)及心肌酶譜比較 CAM組ESR水平明顯高于DM組、PM組(P<0.05)，而DM組、PM組ESR比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。3組CRP、ALT、AST、CK、CK-MB、LDH、HBDH水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表4、表5。

表4 3組病人外周血實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)比較 [ M(Q1，Q3)]

表5 3組病人心肌酶譜比較 [ M(Q1，Q3)] 單位：U/L

2.3.2 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群比較 與健康對(duì)照組比較，DM組、PM組、CAM組外周血T細(xì)胞、自然殺傷(NK)細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、輔助性T淋巴細(xì)胞(Th)1、Th17及調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(Treg細(xì)胞)計(jì)數(shù)均明顯減少(P<0.05)，外周血B細(xì)胞、Th2細(xì)胞計(jì)數(shù)及Th17/Treg差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CAM組外周血NK細(xì)胞、Treg細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于DM組、PM組(P<0.05)。詳見表6、表7。

表6 各組外周血淋巴細(xì)胞亞群水平比較 [ M(Q1，Q3)] 單位：個(gè)/μL

表7 各組外周血CD4+T淋巴細(xì)胞亞群水平比較 [ M(Q1，Q3)]

2.3.3 3組細(xì)胞因子水平比較 DM組、PM組、CAM組外周血IL-2、IL-4、IL-6、IL-10、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。CAM組外周血IFN-γ水平明顯低于DM組、PM組(P<0.05)，但DM組、PM組IFN-γ水平比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。詳見表8。

表8 3組細(xì)胞因子水平比較 [ M(Q1，Q3)] 單位：pg/mL

3 討 論

IIMs是一組全身性自身免疫性疾病，其特征為骨骼肌的慢性炎癥，以DM和PM最為常見。傳統(tǒng)觀點(diǎn)認(rèn)為自身免疫性疾病的發(fā)病機(jī)制是由于效應(yīng)T細(xì)胞的過度激活引起的，近年來，由Treg細(xì)胞數(shù)量和功能失衡引起的免疫耐受被認(rèn)為是自身免疫性疾病的關(guān)鍵起源。且目前已有大量研究證實(shí)免疫平衡的破壞是IIMs發(fā)病的主要原因[6-8]。因此，分析外周血淋巴細(xì)胞亞群有助于了解病人機(jī)體的免疫功能，為免疫治療提供依據(jù)。

本研究結(jié)果顯示，DM、PM、CAM病人外周血淋巴細(xì)胞各亞群如T淋巴細(xì)胞、NK細(xì)胞、CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞、Th1、Th17及Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)均低于健康對(duì)照組，表明外周血淋巴細(xì)胞亞群可能參與DM、PM、CAM的發(fā)病過程，提高外周血淋巴細(xì)胞水平有助于改善病人免疫功能，與孫何花[9]的研究結(jié)果一致。本研究還發(fā)現(xiàn)，相較DM、PM病人，CAM病人外周血Th17細(xì)胞水平基本相近，而Treg細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)卻明顯減少，提示Treg細(xì)胞在CAM微環(huán)境中對(duì)腫瘤的發(fā)展可能起抑制作用，其作用機(jī)制涉及Foxp3+Treg細(xì)胞可重編程分化為效應(yīng)性T細(xì)胞，從而使抗腫瘤免疫表達(dá)增強(qiáng)[10]，或通過抑制炎癥驅(qū)動(dòng)惡性轉(zhuǎn)化的過程以保護(hù)機(jī)體免受惡性腫瘤的侵害[11]。因此，本研究得出Treg耗竭治療策略可能不適用于CAM，相反，升高Treg細(xì)胞水平的靶向免疫治療或許可延緩CAM進(jìn)展，有待進(jìn)一步深入研究。

干擾素(interferon，IFN)是一組多效性細(xì)胞因子，可激活樹突狀細(xì)胞和淋巴細(xì)胞并調(diào)節(jié)細(xì)胞的分化、增殖與凋亡，在機(jī)體免疫應(yīng)答、宿主抵抗病毒細(xì)菌感染以及腫瘤監(jiān)測(cè)中發(fā)揮重要作用[12]。IFN-γ是Ⅱ型IFN的唯一成員，其受體由IFN-γR1和IFN-γR2亞基組成[13-14]，主要來源于NK細(xì)胞、CD4-Th1和CD8細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞[15]，可調(diào)節(jié)多種免疫細(xì)胞類型的分化和功能。本研究發(fā)現(xiàn)，與DM、PM病人比較，CAM病人外周血IFN-γ水平明顯降低，提示在免疫失衡基礎(chǔ)上，IFN-γ水平降低可能參與CAM的發(fā)生，與Huffaker等[16-17]研究結(jié)果腫瘤微環(huán)境中IFN-γ的表達(dá)減慢了腫瘤的生長(zhǎng)相一致。其機(jī)制可能為通過抑制腫瘤細(xì)胞周期，誘導(dǎo)腫瘤缺血以及激活A(yù)PC和效應(yīng)細(xì)胞從而抑制腫瘤生長(zhǎng)[18]，表明IFN-γ在監(jiān)測(cè)和消除腫瘤細(xì)胞中起重要作用。那么干擾IFN-γ的表達(dá)水平或許可減少CAM的發(fā)生，為其治療提供新思路。

本研究中，105例病人發(fā)病年齡以CAM病人較高，表明年齡較大可能是CAM發(fā)生的危險(xiǎn)因素，與Lu等[19-20]研究結(jié)果相似。CK對(duì)于IIMs病人而言敏感性高，特異性差，其升高的程度與肌肉損傷程度平行，但也有少數(shù)病人活動(dòng)期CK水平可以正常[21]。本研究中，CAM病人雷諾現(xiàn)象、抗Jo-1抗體陽性發(fā)生率低于DM、PM病人，而ESR明顯高于DM、PM病人，表明雷諾現(xiàn)象、抗Jo-1抗體陽性是CAM發(fā)生的保護(hù)因素，而ESR增快可增加其發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)3組病人關(guān)節(jié)痛、肌痛癥狀及血清CK水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，可能與樣本量及病情活動(dòng)有關(guān)。間質(zhì)性肺疾病被認(rèn)為是IIMs最常見的系統(tǒng)性并發(fā)癥之一[22]，與預(yù)后較差和死亡率增加相關(guān)[23-24]。Hallowell等[22]報(bào)道PM、DM合并間質(zhì)性肺疾病的病例數(shù)占19.9%～78.0%。本研究結(jié)果顯示，DM、PM、CAM合并間質(zhì)性肺疾病的百分比依次為66.07%、41.67%、16.00%，以CAM合并間質(zhì)性肺疾病最少，表明CAM病人與伴有間質(zhì)性肺疾病的減少相關(guān)，這與Zhang等[25]的Meta分析發(fā)現(xiàn)惡性腫瘤與合并間質(zhì)性肺疾病的風(fēng)險(xiǎn)降低一致。有研究發(fā)現(xiàn)促炎細(xì)胞因子(如IL-6)可刺激中性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞，進(jìn)而引起肺泡上皮細(xì)胞損傷[26]。DM病人較易合并間質(zhì)性肺疾病，可能與其外周血中IL-6水平的較高表達(dá)有關(guān)。本研究中所有伴發(fā)間質(zhì)性肺疾病病人均采用高分辨率CT(HRCT)診斷，既往研究證實(shí)肺活檢組織學(xué)改變與HRCT的檢查結(jié)果一致[27]，且HRCT診斷具有高特異性，高達(dá)90%[28]，故早期DM病人應(yīng)更加注重HRCT檢查以明確有無間質(zhì)性肺疾病的發(fā)生。

綜上所述，DM、PM、CAM病人外周血淋巴細(xì)胞亞群存在免疫失衡，Treg細(xì)胞和IFN-γ的水平降低可能參與CAM的發(fā)生，提示靶向調(diào)節(jié)外周血淋巴細(xì)胞和細(xì)胞因子水平有助于改善病人免疫功能，而預(yù)測(cè)CAM發(fā)生的風(fēng)險(xiǎn)因素將有助于提早干預(yù)，有望為DM、PM、CAM致病機(jī)制的進(jìn)一步探究及提高診治率提供新思路。