miR-146b-3p通過RAF1/p38MAPK/COX-2信號通路影響糖尿病發(fā)生腦梗死的機(jī)制研究

王 劍，王振煥，張欽昌

腦卒中是糖尿病病人動(dòng)脈粥樣硬化性疾病的臨床表現(xiàn)[1-2]。腦梗死是臨床常見病，也是導(dǎo)致人類死亡的主要疾病[3-4]。目前，隨著人們生活質(zhì)量的不斷提高，糖尿病引起的缺血性腦卒中病人在缺血性腦卒中病例中比例越來越高[5-6]。糖尿病合并急性腦梗死病人與非糖尿病合并急性腦梗死病人相比，臨床療效往往較差[7-8]。因此，對糖尿病伴有腦梗死(DMCI)病人進(jìn)行更多關(guān)注和研究顯得尤為重要。近年來，白細(xì)胞介素-6(IL-6)、環(huán)氧化酶-2(cyclooxygenase，COX)與動(dòng)脈血栓形成的關(guān)系引起人們越來越多的關(guān)注。人類miR-146是miRNA的一種，由22個(gè)核苷酸組成，它有兩種形式，分別為miR-146a和miR-146b。miR-146b位于人類的10號染色體(10q24.32)上[9-11]。Fulzele等[12]報(bào)道m(xù)iR-146b-3p與炎癥和動(dòng)脈血栓形成的進(jìn)展和發(fā)展密切相關(guān)。Yang等[13]研究提示miR-146a過表達(dá)可能在動(dòng)脈粥樣硬化的預(yù)防和治療中發(fā)揮作用。此外，腺苷酸活化蛋白激酶(MAPK)是多種miRNA的潛在靶基因[14-15]，提示MAPK可能通過調(diào)控miRNA在動(dòng)脈血栓形成中的功能，促進(jìn)動(dòng)脈血栓形成。然而，miR-146b是否或如何參與DMCI的病理機(jī)制目前尚不清楚。糖尿病被認(rèn)為是腦梗死的獨(dú)立危險(xiǎn)因素，可加重神經(jīng)細(xì)胞凋亡，提高腦梗死致殘率和死亡率，近年來，對DMCI的病理機(jī)制進(jìn)行了深入研究，但對DMCI信號轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制知之甚少。本研究主要探討miR-146b-3p在糖尿病合并腦梗死發(fā)展中的作用，并闡述其部分分子機(jī)制。

1 資料與方法

1.1 研究對象 選取我院2015年4月—2017年12月收治的210例糖尿病病人為研究對象，對血栓事件發(fā)生率進(jìn)行隨訪研究。糖尿病診斷依據(jù)1999年《世界衛(wèi)生組織糖尿病診斷標(biāo)準(zhǔn)》；腦梗死診斷依據(jù)美國心臟協(xié)會(huì)/美國卒中協(xié)會(huì)(ASA)于2013年制定的標(biāo)準(zhǔn)[16]，并經(jīng)顱內(nèi)計(jì)算機(jī)斷層掃描磁共振成像(MRI)或兩者同時(shí)證實(shí)。排除標(biāo)準(zhǔn)：肝、腎、甲狀腺功能障礙；有心臟病、自身免疫性疾病、癌癥、感染性疾病、腦出血史的病人；1個(gè)月內(nèi)有外傷或手術(shù)病人。

1.2 酶聯(lián)免疫吸附法(ELISA)檢測 血清IL-6和COX-2總蛋白含量采用ELISA檢測，采集外周血標(biāo)本，空腹靜脈采血10 mL，體外用0.129 mmol/L檸檬酸鈉抗凝，充分搖管，室溫保存檢查。所有樣本至少重復(fù)檢測3次。

1.3 外周血單核細(xì)胞(PBMC)分離 清晨抽取病人外周血4 mL，肝素抗凝，低速離心15 min。然后以RPMI 1640培養(yǎng)基體積稀釋中間層白膜約1 mL，混合后緩慢擴(kuò)散于2 mL淋巴細(xì)胞的分離液表面。從分離液和RPMI 1640中間分離出單核細(xì)胞，洗滌3次保存。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(RT-PCR)檢測 使用total RNA試劑盒(Qiagen)從PBMC中提取得到總RNA，進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，構(gòu)建cDNA文庫，最終采用RT-PCR進(jìn)行檢測miR-146b-3p、RAF1、COX-2的表達(dá)。通過SYBR Green Master Mix Kit和ABI 7500 real-time PCR系統(tǒng)(Applied Biosystems， Waltham， MA)測定，并歸一化為GDPAH。相關(guān)基因引物見表1。具體的PCR條件參考文獻(xiàn)[17]。每個(gè)基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)研究重復(fù)3次。

表1 基因引物序列

1.5 免疫印跡法(Western Blot)檢測 根據(jù)細(xì)胞量加入適量RIPA細(xì)胞裂解液，提取各組細(xì)胞的蛋白。配制10%SDS-PAGE，每孔加入30 μg蛋白樣品，經(jīng)SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜，5%脫脂奶粉封閉2 h， TBST稀釋一抗(1∶1 000稀釋)，4 ℃過夜；加入羊抗兔二抗(1∶2 000稀釋)，室溫孵育2 h；ECL發(fā)光：實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。主要抗體為單克隆小鼠抗人COX-2 (1∶1 000， abcam， mouse)、兔抗人RAF1 (1∶5 000，abcam， rabbit)、 單克隆兔抗人p-p38MAPK (1∶1 000， cell signaling， rabbit)、兔抗人p38MAPK (1∶5 000，cell signaling， rabbit)、單克隆小鼠抗人P-STAT3 (1∶5 000， abcam， mouse)、兔抗人STAT3抗體 (1∶1 000， abcam， rabbit)和兔抗人GAPDH抗體 (1∶1 000， cell signaling， rabbit)。上述抗體均購自美國CST公司。

2 結(jié) 果

2.1 隨訪期間血栓事件發(fā)生情況 本研究中，210例病人隨訪時(shí)間為(8.1～21.3)個(gè)月。共發(fā)生血栓事件33例(包括腦梗死15例，心肌梗死18例)，血栓事件發(fā)生率為15.71%。將發(fā)生腦梗死的15例歸入DMCI組，男10例，女5例；年齡56～84(72.15±1.17)歲。另選取15例無腦梗死病人為對照組，男10例，女5例；年齡58～77(74.85±3.31)歲。

2.2 兩組臨床資料比較(見表2)

表2 兩組臨床資料比較

2.3 DMCI組與對照組外周血IL-6、COX-2的表達(dá)比較 利用ELISA法檢測病人外周血IL-6和COX-2含量顯示，與對照組相比，DMCI組血IL-6和COX-2表達(dá)均明顯升高(P<0.05)。詳見圖1、圖2。

2.4 IL-6在外周血單核細(xì)胞中誘導(dǎo)COX-2表達(dá)比較 在外周血單核細(xì)胞中加入IL-6進(jìn)行誘導(dǎo)，發(fā)現(xiàn)COX-2的mRNA和蛋白表達(dá)明顯增加，隨著IL-6的升高，COX-2明顯降低。其中COX-2 mRNA表達(dá)在IL-6刺激后1 h達(dá)到峰值；COX-2蛋白表達(dá)略晚于mRNA，在IL-6誘導(dǎo)后2 h達(dá)到峰值，然后逐漸下降(P<0.01)。詳見圖3。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，COX-2的表達(dá)受IL-6的調(diào)控。

與對照組比較， ＊P<0.05。圖1 ELISA檢測外周血IL-6水平(n=3)

與對照組比較， ＊P<0.05。圖2 ELISA法檢測外周血COX-2水平(n=3)

圖3 IL-6誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞COX-2表達(dá)(n=3)

2.5 DMCI組與對照組miR-146b-3p表達(dá)比較 采用RT-PCR技術(shù)檢測15例DMCI病人miR-146b-3p的表達(dá)情況。結(jié)果顯示，與對照組相比，miRNA-146b-3p mRNA在15例DMCI病人中的表達(dá)均下調(diào)(見圖4A)；DMCI組miR-146b-3p mRNA的表達(dá)低于對照組(0.16±0.07與1.12±0.16，P<0.001)。詳見圖4B。

與對照組比較，＊P<0.001。圖4 采用RT-PCR技術(shù)檢測DMCI病人miR-146b-3p表達(dá)情況

2.6 DMCI組病人RAF1及P38MAPK的表達(dá)情況 采用PCR技術(shù)檢測DMCI病人RAF1表達(dá)情況，通過免疫印跡方法檢測RAF1、p38MAPK、COX-2蛋白的表達(dá)。結(jié)果顯示，與對照組比較，DMCI組RAF1 mRNA表達(dá)均增加(見圖5A)，DMCI組RAF1 mRNA表達(dá)高于對照組(P<0.001，見圖5B)，且蛋白表達(dá)也是增加的(見圖5C)；檢測COX-2、p38MAPK及p-p38MAPK蛋白表達(dá)，發(fā)現(xiàn)在DMCI病人中COX-2、p-p38MAPK表達(dá)是增加的，p38MAPK蛋白的表達(dá)是減少的(見圖5C)，說明DMCI病人中p38MAPK磷酸化激活了p38MAPK的信號通路。

與對照組比較，＊P<0.001。圖5 兩組病人中RAF1及p38MAPK蛋白表達(dá)情況

2.7 IL-6激活STAT3、下調(diào)miR-146b-3p誘導(dǎo)COX-2在外周血單核細(xì)胞中的表達(dá) DMCI組與對照組外周血IL-6、COX-2的表達(dá)結(jié)果顯示COX-2的表達(dá)受IL-6的調(diào)控，因此，進(jìn)一步探討IL-6與miR-146b-3p及COX-2之間的聯(lián)系。結(jié)果顯示，當(dāng)用10 ng/mL的IL-6處理外周血單核細(xì)胞(PBMC)時(shí)，處理5 min時(shí)可激活STAT3磷酸化，處理15 min后p-STAT3表達(dá)達(dá)峰值，然后逐漸下降(P<0.01，見圖6A)。當(dāng)IL-6處理PBMC 1 h后，miR-146b-3p mRNA表達(dá)明顯下降，且下降趨勢明顯(見圖6B)。當(dāng)IL-6處理12 h后，發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p mRNA在IL-6 處理12 h時(shí)表達(dá)為(0.20±0.12)，低于對照組的(1.02±0.15)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05，見圖6C)。經(jīng)IL-6處理后COX-2的mRNA為(4.98±0.69)和蛋白質(zhì)表達(dá)高于對照組(1.46±0.23，P<0.05，見圖6D、圖6E)。

與對照組比較，＊P<0.05。圖6 IL-6激活STAT3、下調(diào)miR-146b-3p誘導(dǎo)外周血單核細(xì)胞中COX-2表達(dá)

2.8 DMCI組其他miRNAs的表達(dá)情況 通過RT-PCR檢測DMCI組病人中其他35個(gè)miRNAs的表達(dá)情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，DMCI組有23個(gè)miRNAs表達(dá)降低(包括miR-146b-3p)，12個(gè)miRNAs表達(dá)上調(diào)(見圖7)；DMCI組miR-146a表達(dá)也是降低的，與miR-146b的表達(dá)趨勢一致，說明miR-146a與miR-146b在大腦發(fā)育和進(jìn)展中發(fā)揮類似作用，相關(guān)作用機(jī)制有可能也是相似的。

圖7 RT-PCR檢測DMCI組中35個(gè)miRNAs的相對表達(dá)

3 討 論

炎癥是腦梗死后嚴(yán)重的生理反應(yīng)之一[18-19]。有研究認(rèn)為糖尿病可加重缺血性腦彌散后的急性炎癥反應(yīng)，增加腦組織的炎性因子表達(dá)，其中炎性因子COX分為COX-1和COX-2兩大類[20-22]。在人的腦組織中， COX-2通常位于皮質(zhì)、海馬、下丘腦和脊索中樞，在其他炎癥因素的刺激下，COX-2的表達(dá)明顯增加，如炎癥細(xì)胞因子IL-6、腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、血管緊張素Ⅱ (Ang Ⅱ)等[23-26]。既往研究報(bào)道，COX-2不僅介導(dǎo)全身炎癥反應(yīng)，而且在動(dòng)脈粥樣硬化病變中起重要作用，受多種炎癥細(xì)胞因子調(diào)控[27-29]。本研究中，與正常組比較，DMCI組病人血清中IL-6、COX-2表達(dá)明顯升高。目前，一些miRNA已被證實(shí)在動(dòng)脈粥樣硬化病理生理學(xué)中發(fā)揮關(guān)鍵作用[30-32]。本研究結(jié)果顯示，與正常組比較，DMCI組miR-146b-3p明顯下調(diào)，證實(shí)miR-146b-3p調(diào)控RAF1表達(dá)，最終使p38MAPK信號激活。DMCI組病人miR-146b-3p表達(dá)下調(diào)，從而誘導(dǎo)了RAF1的表達(dá)增加，然后激活誘導(dǎo)COX-2上調(diào)的p38MAPK信號通路，最終促進(jìn)動(dòng)脈血栓的形成。此外，IL-6被證實(shí)可以刺激單核細(xì)胞中STAT3的表達(dá)，而單核細(xì)胞中STAT3的表達(dá)與STAT信號通路密切相關(guān)[33-35]。識別STAT3的結(jié)合位點(diǎn)存在于miR-146b-3p中，miR-146b-3p的表達(dá)與STAT3的重構(gòu)密切相關(guān)[36]。

本研究還證實(shí)STAT3信號通路在動(dòng)脈血栓形成過程中被激活，這與IL-6的上調(diào)密切相關(guān)。STAT3誘導(dǎo)miRNA-146b-3p下調(diào)。DMCI的發(fā)展也證實(shí)了COX-2通過MAPK信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)控表達(dá)。有效靶向miR-146b-3p/RAF1/P38MAPK/COX-2信號通路的干預(yù)，將為DMCI的防治提供潛在靶點(diǎn)。本研究只比較了DMCI病人與無腦梗死的糖尿病病人間差異，其他并發(fā)癥的糖尿病病人或僅缺血性卒中病人不包括在內(nèi)。miR-146b-3p通過抑制ADA2參與調(diào)節(jié)糖尿病退行性炎癥，提示miR-146b與糖尿病微血管并發(fā)癥的關(guān)系[37]；其他研究證實(shí)miR-146a表達(dá)在糖尿病缺血性腦卒中病人中表達(dá)下調(diào)，但僅在缺血性腦卒中病人中表達(dá)下調(diào)，血液中miR-146a低表達(dá)是我國糖尿病病人缺血性卒中的危險(xiǎn)因素[38-40]。本研究也發(fā)現(xiàn)DMCI病人中miR-146a表達(dá)是下調(diào)的，結(jié)果提示了miR-146b與DMCI之間的關(guān)系，也可以認(rèn)為miR-146a在大腦的發(fā)育和進(jìn)展中發(fā)揮了作用。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-146b-3p的表達(dá)通過介導(dǎo)RAF1/P38MAPK/COX-2信號通路與DMCI的發(fā)展密切相關(guān)。miR-146b-3p表達(dá)異常似乎是DMCI發(fā)展的關(guān)鍵因素，可能成為DMCI檢測和干預(yù)的新靶點(diǎn)。