雞樅菌菌圃微生物的分離純化及初步鑒定

張明星 李 潔 張玄妮 李歡歡 謝 娟 徐學(xué)鋒

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣州 510642）

雞樅菌（Termitomyces spp.）主要分布于非洲南部、南亞、東亞以及南太平洋島嶼等熱帶、亞熱帶地區(qū)，且有研究表明，亞洲與非洲的雞樅菌存在明顯的洲際地理差異[1-2]。目前，我國(guó)江蘇、福建、臺(tái)灣、廣東、廣西、四川、貴州、云南等省均有雞樅菌分布[3]。鑒于雞樅菌與白蟻具有緊密的共生關(guān)系[雞樅菌與白蟻共棲于同一生境“菌圃”（即蟻巢，是由白蟻、白蟻排泄物、雞樅菌及相關(guān)的環(huán)境微生物協(xié)調(diào)發(fā)育而成的一個(gè)共生生態(tài)系統(tǒng)）中]，故其分布范圍與大白蟻亞科（Macrotermitinae）的分布極為相近[4-5]。

雞樅菌菌圃中存在大量的微生物，常見(jiàn)真菌類群有炭角菌屬（Xylaria）、擬青霉屬 （Paecilomyces）、木霉屬（Trichoderma）、曲霉屬（Aspergillus）等17屬[6-7]。有研究發(fā)現(xiàn)，雖然菌圃中存在大量對(duì)雞樅菌生長(zhǎng)有威脅的微生物，尤其是炭角菌屬真菌和木霉屬真菌，且這些真菌也能在菌圃被遺棄時(shí)迅速占領(lǐng)菌圃成為優(yōu)勢(shì)菌群[8-9]，從而影響雞樅菌的生長(zhǎng)。但通過(guò)分子手段在活的菌圃中僅能檢測(cè)到雞樅菌[10]，且相關(guān)研究也表明，菌圃中存在能抑制這些真菌生長(zhǎng)的微生物。例如，菌圃中的芽孢桿菌屬（Bacillus）能保護(hù)菌圃免受哈茨木霉菌（Trichoderma harzianum）的入侵[11-12]，放線菌（Actinobacteria）能抑制假單胞菌（Pseudomonnas）的生長(zhǎng)[13]。當(dāng)然，菌圃中并非所有的真菌都不利于雞樅菌的生長(zhǎng)，例如，真菌Gigantropanus sp.能在體外刺激雞樅菌菌絲體的生長(zhǎng)[14]。基于這種復(fù)雜的共生關(guān)系，雞樅菌生長(zhǎng)的秘密始終未被揭示，使得人工馴化困難重重。在此背景下，筆者擬通過(guò)分離純化雞樅菌菌圃中的微生物，研究菌圃內(nèi)部微生物的主體類群，并進(jìn)一步分析菌圃內(nèi)部微生物的相關(guān)聯(lián)系，從而為闡明雞樅菌-白蟻-菌圃三元共生體系的內(nèi)在聯(lián)系提供初步的研究方向?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報(bào)道如下。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

野生雞樅菌子實(shí)體和菌圃發(fā)現(xiàn)于華南農(nóng)業(yè)大學(xué)，并由食品學(xué)院應(yīng)用真菌實(shí)驗(yàn)室保存。

試驗(yàn)試劑為牛肉膏、蛋白胨、酵母浸膏、麥芽浸提物、可溶性淀粉、高氏一號(hào)培養(yǎng)基（廣東環(huán)凱微生物科技有限公司），葡萄糖、氫氧化鈉、鹽酸、氯化鉀（天津福晨化學(xué)試劑廠），氯化鈣、氯化鈉、重鉻酸鉀（天津富宇精細(xì)化工有限公司），鏈霉素、氨芐青霉素（美國(guó)Biosharp公司），膽酸鈉（天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司），磷酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖液（pH=6.85）、硼酸鹽標(biāo)準(zhǔn)緩沖溶液（pH=9.14）（天津市天新精細(xì)化工有限公司）。

試驗(yàn)儀器為HVE-50型全自動(dòng)高壓滅菌鍋（日本Hirayama公司）、Mettler-Toledo GB204型電子天平（瑞士梅特勒-托利多公司）、電子顯微鏡XSP-8CE（上海蔡康光學(xué)儀器公司）、SW-CJ-1F超凈工作臺(tái)（江蘇蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）、TG-16W臺(tái)式高速離心機(jī)（長(zhǎng)沙湘智離心機(jī)儀器有限公司）、FSH-2A可調(diào)高速均質(zhì)機(jī)（常州市國(guó)旺儀器制造有限公司）、LRH-250A型生化培養(yǎng)箱（廣東省醫(yī)療器械廠）、SPH-2102C立式恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海四平試驗(yàn)設(shè)備有限公司）。

1.2 菌種分離配方

1.2.1 土壤浸提液

土壤取自菌圃周圍。土壤與水按質(zhì)量比1∶1攪拌混合均勻，取上清液。

1.2.2 牛肉蛋白胨培養(yǎng)基

配方為牛肉膏5.0 g、蛋白胨10.0 g、瓊脂20.0 g，用土壤浸提液定容至1 L，pH為7.4～7.6，在121 ℃高壓條件下滅菌20 min。

1.2.3 改良馬丁培養(yǎng)基

配方為葡萄糖10.0 g、蛋白胨5.0 g、磷酸二氫鉀1.0 g、硫酸鎂1.0 g、瓊脂20.0 g，用土壤浸提液定容至1 L。

1.2.4 改良高氏培養(yǎng)基

取高氏一號(hào)培養(yǎng)基22.5 g，用土壤浸提液定容至1 L。

1.2.5 分散劑

1%膽酸鈉、7%生理鹽水用于細(xì)菌和真菌分離；1%焦磷酸鈉、7%生理鹽水用于放線菌分離。

1.2.6 抑菌劑

用鏈霉素10 mg/L、青霉素80 mg/L、重鉻酸鉀55 mg/L進(jìn)行真菌分離，用重鉻酸鉀10 mg/L進(jìn)行放線菌分離，細(xì)菌分離則不加抑菌劑。鏈霉素、青霉素采用0.22 μm的微孔過(guò)濾膜過(guò)濾除菌，重鉻酸鉀采用高溫高壓滅菌。

1.3 試驗(yàn)方法

微生物分離方式參考閆偉[15]提及的方式，并對(duì)其分離條件進(jìn)行適當(dāng)優(yōu)化。分離在無(wú)菌條件下操作，取1 g不同位置的菌圃，放入裝有99 mL分散劑的250 mL錐形瓶中，在轉(zhuǎn)速10 000 r/min條件下工作1 min左右，再加10粒無(wú)菌玻璃珠，于28 ℃恒溫?fù)u床上振蕩6 h，然后進(jìn)行10倍梯度稀釋，稀釋倍數(shù)為10-2至10-6。

待溶解培養(yǎng)基溫度降至45～55 ℃時(shí)，加入相應(yīng)的抑菌劑并混勻，倒平板。取0.1 mL的菌圃稀釋液涂布分離，細(xì)菌分別在10-4、10-5、10-6梯度上取，放線菌分別在10-3、10-4、10-5梯度上取，真菌分別在10-2、10-3、10-4梯度上取，每個(gè)梯度均設(shè)3次重復(fù)。

細(xì)菌和放線菌培養(yǎng)2～7 d，每天觀察記錄菌落形態(tài)，然后依據(jù)菌落形態(tài)進(jìn)行分離純化，再進(jìn)行革蘭氏染色，然后進(jìn)行鏡檢。

將純化的真菌菌株接種于PDA平板上，置于25℃培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，每隔24 h觀察菌落顏色、質(zhì)地、形態(tài)以及培養(yǎng)基顏色、滲出物、氣味等，同時(shí)結(jié)合顯微形態(tài)對(duì)真菌進(jìn)行初步鑒定，并統(tǒng)一編號(hào)。真菌形態(tài)學(xué)特征鑒定主要參照《真菌鑒定手冊(cè)》《土壤真菌手冊(cè)》《中國(guó)真菌志》等資料。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌和放線菌分離純化

根據(jù)雞樅菌菌圃中可培養(yǎng)菌株在平板上和在顯微鏡下的形態(tài)特征，對(duì)菌種進(jìn)行初步分離，結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，從菌圃中分離出的細(xì)菌和放線菌菌株共有383株，菌落形狀以橢圓形為主，大多呈扁平、隆起，表面質(zhì)地以濕潤(rùn)居多；菌株多為桿狀，其次為球狀；菌株以革蘭氏陽(yáng)性為主，革蘭氏陰性菌株僅44株。

表1 菌圃中可培養(yǎng)細(xì)菌和放線菌分離株形態(tài)特征

2.2 真菌分離及初步鑒定

由表2可知，經(jīng)初步分離，得到了47株絲狀真菌，通過(guò)查閱相關(guān)文獻(xiàn)，以其形態(tài)學(xué)特征為依據(jù)，初步鑒定出43株菌株，有4株無(wú)法鑒定。在這43株菌株中，有17株為木霉屬，6株為曲霉屬，3株為炭角菌屬，5株為青霉屬，3株為交鏈孢霉屬，3株為鐮孢霉屬，1株為鏈霉菌屬，1株為高山被孢霉屬，1株為毛霉屬，1株為截盤多毛孢屬，1株為枝孢霉屬，1株為雞樅菌屬。43株絲狀真菌菌株的具體特征見(jiàn)表3。

表2 菌圃中真菌分離株在各屬的分布

表3 菌圃中真菌分離株的具體特征

3 結(jié)論與討論

鑒于菌圃微生物的分離受分散劑、分散方式、培養(yǎng)基及培養(yǎng)條件等因素的影響，本研究在參考閆偉[15]的分離方法后，根據(jù)本研究材料特點(diǎn)，對(duì)分散劑、分散方式、培養(yǎng)基等進(jìn)行了適當(dāng)優(yōu)化，最終取得了較好的分離效果，從雞樅菌菌圃中成功分離出了383株細(xì)菌及放射菌、47株絲狀真菌，其中能根據(jù)菌株形態(tài)學(xué)特征進(jìn)行初步鑒定的絲狀真菌有43株。但這43株絲狀真菌的屬與前人研究結(jié)果（雞樅菌圃中主要存在的絲狀真菌有炭角菌、木霉、青霉、擬青霉、曲霉、芽枝霉等[8-9,16-17]）有所差異。另外，本試驗(yàn)除了分離出炭角菌、木霉、青霉、曲霉等真菌外，還分離出了交鏈孢霉、鐮孢霉、鏈霉菌、高山被孢霉、毛霉等真菌，這可能與白蟻所處的地域、白蟻的飲食和習(xí)性有關(guān)。

鑒于雞樅菌菌圃成熟程度不同，其菌群結(jié)構(gòu)存在差異，在以后的研究中，可利用人工飼養(yǎng)系統(tǒng)[18]，對(duì)婚飛前（剛婚飛）的白蟻巢穴中的菌圃和出菇后的菌圃進(jìn)行挖掘，并以白蟻新鮮糞便為對(duì)照，全面觀察雞樅菌生長(zhǎng)周期中的菌群變化情況，找出其中主要發(fā)生變化的菌群，并對(duì)其基質(zhì)成分進(jìn)行分析，以期了解菌群變化與基質(zhì)成分之間的關(guān)系。同時(shí)，未來(lái)也可通過(guò)共同培養(yǎng)，探明對(duì)雞樅菌生長(zhǎng)有促進(jìn)作用的真菌菌株。