特殊飼料飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的構(gòu)建與研究

李 晴 朱建國

（1上海交通大學(xué)農(nóng)業(yè)與生物學(xué)院/上海市獸醫(yī)生物技術(shù)重點實驗室，上海 200240；2上海睿智化學(xué)研究有限公司，上海 200120）

非酒精性脂肪肝?。∟on-alcoholic Fatty Liver Disease, NAFLD）是全球最為常見的肝臟疾病之一[1]。隨著人們生活水平的提高以及生活習(xí)慣、飲食結(jié)構(gòu)的改變，肥胖和糖尿病的發(fā)病率增加，NAFLD的發(fā)病率也呈上升趨勢，其中，有10%～20%的NAFLD可發(fā)展為非酒精性脂肪性肝炎（non-alcoholic steatohepatitis，NASH）。

NASH以肝臟脂肪浸潤、炎性反應(yīng)、肝細(xì)胞損害、壞死和纖維化為特征，有發(fā)展為肝纖維化、肝硬化、肝衰竭和肝細(xì)胞癌的風(fēng)險[2]。然而，目前關(guān)于NASH的發(fā)病機(jī)制仍不清楚，仍需對NASH的病理生理學(xué)和分子生物學(xué)發(fā)病機(jī)制等進(jìn)行深入研究，以利于臨床診斷和治療[3]。為此，醫(yī)學(xué)界建立了多個疾病動物模型，以探明NASH的發(fā)病機(jī)制。從現(xiàn)有的研究成果來看，疾病動物模型主要分為藥物中毒性脂肪肝動物模型、特殊品系脂肪肝動物模型、營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型、復(fù)合因素誘導(dǎo)的脂肪肝動物模型[4]。其中，營養(yǎng)失調(diào)性脂肪肝動物模型，是給予高脂肪、高糖飼料喂養(yǎng)建立的脂肪肝模型，即在食物中添加過量脂類、膽固醇和糖類，從而使動物無法完全吸收利用，使脂類堆積于肝而引起脂肪肝，進(jìn)一步出現(xiàn)肝炎和肝臟纖維化，該模型與人類的NASH相似，且病變有漸進(jìn)性過程，便于藥物干預(yù)，但該模型的缺點也較為明顯，如病變輕、造模時間較長（約需喂養(yǎng)半年以上）[5]。因此，尋求出更理想的模型對于該疾病的藥物篩選意義重大。在此背景下，筆者構(gòu)建了特殊飼料飲食誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型，并對該模型進(jìn)行了驗證?，F(xiàn)將相關(guān)研究結(jié)果報道如下。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

選用SPF級C57BL/6J雄性小鼠，4～5周齡，180只，購于北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司，飼養(yǎng)于鋪有玉米芯墊料的聚碳酸酯籠盒內(nèi)，動物房溫度控制在21～25 ℃，濕度控制在40%～70%，12 h光照、循環(huán)（7:00～19:00）。小鼠所用飼料為美國公司Research Diets生產(chǎn)的專業(yè)嚙齒類實驗動物飼料，普通飼料型號為Rodent Diet#5001，特殊飼料型號為D09100301，飼料成分見表1和表2。實驗前，小鼠在SPF級動物房內(nèi)適應(yīng)1周，待獸醫(yī)評估動物狀態(tài)，確定能夠作為實驗動物后再進(jìn)行實驗。

表1 特殊飼料組成成分

表2 特殊飼料營養(yǎng)成分 （單位：%）

1.2 儀器與試劑

主要試劑為：谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）、甘油三酯（TG）、總膽固醇（TC）、胰島素試劑盒，金屬蛋白酶抑制劑-1（TIMP-1）、血清細(xì)胞角蛋白-18（CK-18）、透明質(zhì)酸（HA）、III型前膠原N端肽（PIIINP），均購自Merck Millipore。

主要儀器為：酶標(biāo)儀（Bio-Tek U.S.A）、COBAS600型全自動生化分析儀（德國羅氏診斷公司）、超薄切片機(jī)（德國Leica CM3050S）、BMJIII型包埋機(jī)（常州市中威電子儀器廠）、Tissue-Tek VIP自動脫水機(jī)（SAKURA INC）、光學(xué)顯微鏡照相系統(tǒng)（日本OLYMPUS）。

1.3 實驗設(shè)計

根據(jù)小鼠體重，挑選160只體型健壯的小鼠進(jìn)行實驗，并將其隨機(jī)分為2組，分別為普通飼料組和特殊飼料組，并分別在第2、4、5、7.5個月每組各安樂死20只小鼠，進(jìn)行生物學(xué)指標(biāo)檢測。

1.4 檢測項目

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的生物學(xué)指標(biāo)具體為：小鼠的體重，附睪脂肪和肝臟的重量；餐后血糖水平和胰島素水平；膽固醇和甘油三酯的水平；炎癥和肝功能的生物標(biāo)記物（細(xì)胞角質(zhì)素CK18、丙谷轉(zhuǎn)氨酶、天門冬氨酸轉(zhuǎn)移酶）；肝臟纖維化的生物標(biāo)記物（透明質(zhì)酸、金屬蛋白酶抑制劑-1、III型前膠原氨基端肽）。

非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型采用NAS進(jìn)行評分，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差（Mean±SEM）表示，采用單因素分析和獨立樣本t檢驗進(jìn)行誤差顯著性分析，使用Graph Pad Prism 5.0進(jìn)行圖形分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體重、附睪脂肪和肝臟重量的變化

由圖1、圖2、圖3可知，從喂養(yǎng)的第2個月開始，特殊飼料組小鼠體重、附睪脂肪和肝臟重量顯著性高于普通飼料組。

圖1 實驗期間小鼠體重的變化情況

圖2 實驗期間小鼠附睪脂肪重量的變化情況

圖3 實驗期間小鼠肝臟重量的變化情況

2.2 餐后血糖和胰島素水平的變化

由圖4、圖5可知，實驗期間普通飼料組和特殊飼料組的小鼠餐后血糖無明顯區(qū)別，但從第2個月開始，特殊飼料組的小鼠餐后胰島素水平顯著高于普通飼料組。

圖4 實驗期間小鼠餐后血糖水平的變化情況

圖5 實驗期間小鼠胰島素水平的變化情況

2.3 血漿中膽固醇和甘油三酯的變化

由圖6、圖7可知，實驗期間普通飼料組和特殊飼料組的小鼠血漿中甘油三酯水平無明顯區(qū)別，但從第2個月開始，特殊飼料組的小鼠血漿中膽固醇水平顯著高于普通飼料組。

圖6 實驗期間小鼠血漿中膽固醇水平的變化情況

圖7 實驗期間小鼠血漿中甘油三酯水平的變化情況

2.4 炎癥和肝功能生物標(biāo)記物的變化

由圖8、圖9、圖10可知，從第2個月開始，特殊飼料組的小鼠的細(xì)胞角蛋白含量顯著高于普通飼料組，且伴有時間依賴性。從第5個月開始，特殊飼料組的小鼠的丙谷轉(zhuǎn)氨酶含量和天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量顯著高于普通飼料組，且也伴有時間依賴性。

圖8 實驗期間小鼠的細(xì)胞角蛋白含量變化情況

圖9 實驗期間小鼠的丙谷轉(zhuǎn)氨酶含量變化情況

圖10 實驗期間小鼠的天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶含量變化情況

2.5 肝臟纖維化生物標(biāo)記物的變化

由圖11、圖12、圖13可知，在整個實驗期間，特殊飼料組和普通飼料組的小鼠的透明質(zhì)酸含量無明顯區(qū)別。從第7.5個月開始，特殊飼料組的小鼠的金屬蛋白酶抑制含量和III型前膠原氨基端肽含量顯著高于普通飼料組。

圖11 實驗期間小鼠的透明質(zhì)酸含量變化情況

圖12 實驗期間小鼠的金屬蛋白酶抑制劑含量變化情況

圖13 實驗期間小鼠的Ⅲ型前膠原氨基端肽含量變化情況

2.6 非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型的NAS（NAFLD,Activity Score）評分

對小鼠模型進(jìn)行NAFLD活動度評估，即NAS評分。對肝臟病理改變的3項[小葉內(nèi)炎癥（0～3）、脂肪變性（0～3）和肝細(xì)胞氣球樣變（0～3）]進(jìn)行半定量評估計分（0～12），具體結(jié)果見圖14、圖15、圖16。根據(jù)NAS總分值進(jìn)行診斷（標(biāo)準(zhǔn)為：NAS＜3，排除NASH；NAS≥4，可診斷為NASH）。由圖17可知，喂食5個月后，特殊飼料組的小鼠模型NAS評分＞4，可診斷為NASH。

圖14 實驗期間小鼠的小葉內(nèi)炎癥評估情況

圖15 實驗期間小鼠的脂肪變性評估情況

圖16 實驗期間小鼠的肝細(xì)胞氣球樣變評估情況

圖17 小鼠模型的NAS評分

3 結(jié)果與討論

近年來，非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病率呈逐年上升的趨勢，已嚴(yán)重威脅到人體健康，且目前仍無有效的治療手段。因此，建立理想的非酒精性脂肪性肝炎動物模型對于深入研究該疾病的發(fā)生、治療和預(yù)防均具有重要意義。

目前，人們對非酒精性脂肪性肝炎的發(fā)病機(jī)制并不十分清楚（推測遺傳敏感性和多元代謝絮亂的相互作用可能是致病的重要因素，如氧應(yīng)激和脂質(zhì)過氧化損傷、胰島素抵抗、線粒體功能障礙、細(xì)胞因子、細(xì)胞凋亡、細(xì)胞色素P450、脂聯(lián)素、遺傳因素和免疫反應(yīng)等）[6]，且目前還沒有一個能完整反映人類非酒精性脂肪性肝炎的組織病理學(xué)和病理生理學(xué)特征的動物模型（現(xiàn)有的動物模型很少或僅能部分重現(xiàn)人類非酒精性脂肪性肝炎的病理特征，很多重要的病變?nèi)缫葝u素抵抗和纖維化均沒有再現(xiàn)）[7]。因此，亟需一個理想的動物模型來盡可能地模擬臨床病人的發(fā)病過程和致病機(jī)制。

本實驗所構(gòu)建的利用特殊飼料誘導(dǎo)非酒精性脂肪性肝炎雄性C57小鼠模型，在病因?qū)W、組織病理學(xué)和全身疾病等方面，均與人類非酒精性脂肪性肝炎極為相似。經(jīng)分析，構(gòu)建的小鼠模型具有穩(wěn)定性好、可重復(fù)性高、方法簡便、病死率低、病變有漸進(jìn)性過程、造模停止后逆轉(zhuǎn)緩慢、便于藥物干擾等特點，是研究非酒精性脂肪性肝炎發(fā)病機(jī)制和尋求臨床治療策略的一個很好的工具和平臺，適合多種藥物干預(yù)方式及相關(guān)疾病的機(jī)制研究，是理想的治療非酒精性脂肪性肝炎藥物的篩選模型。因此，本實驗構(gòu)建小鼠模型可用于非酒精性脂肪性肝炎藥物藥效實驗的篩選。