膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白-1在管腔型乳腺癌組織中表達(dá)及其與預(yù)后的關(guān)系

劉磊，楊長俊

乳腺癌是威脅女性生命健康的常見惡性腫瘤，臨床上一般根據(jù)雌激素受體（estorgen receptor，ER）、孕激素受體（progesterone receptor，PR）和人類表皮生長因子受體-2（human epidermal growth factor receptor-2，HER-2）表達(dá)情況對乳腺癌進(jìn)行分類，包括管腔（Luminal）型、HER-2過表達(dá)型及基底樣（Basal-like）型。其中Luminal型又可分為Luminal A型和Luminal B型，預(yù)后相對較好，但遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移、局部復(fù)發(fā)仍然存在。Hedgehog信號通路可參與胚胎生長分化、器官形成、組織修復(fù)等生理過程，并與腫瘤發(fā)生密切相關(guān)。膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白-1（glioma oncogene protein 1，Gli1）是作為Hedgehog信號通路中的下游轉(zhuǎn)錄因子，能反映Hedgehog信號通路活化狀態(tài)及靶基因轉(zhuǎn)錄情況。國外有研究顯示，Gli1陽性表達(dá)與Luminal A型乳腺癌病人的臨床預(yù)后較差有關(guān)，但國內(nèi)尚無相關(guān)研究報道。鑒于此，本研究旨在分析Gli1蛋白在Luminal型乳腺癌組織中表達(dá)情況及其與預(yù)后的關(guān)系，現(xiàn)報告如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取信陽市中心醫(yī)院2012年7月至2014年7月收治的68例Luminal型乳腺癌病人臨床資料進(jìn)行回顧性分析。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）原發(fā)性乳腺癌；（2）術(shù)后病理檢查為Luminal型乳腺癌；（3）術(shù)前未采取任何治療；（4）無卵巢癌或乳腺癌史。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前有遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移者；（2）男性乳腺癌；（3）隨訪資料不完整者。入組病人年齡范圍23～84歲，年齡（57.21±10.38）歲，Luminal A型28例，Luminal B型40例。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要試劑

鼠抗人Gli1單克隆抗體購自上海群己生物科技有限公司；SP免疫組化試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司；DAB顯色試劑盒購自丹麥Dako公司。

1.3 免疫組化及判定方法

采用免疫組化SP法檢測Gli1蛋白表達(dá)情況。根據(jù)SP試劑盒說明書步驟進(jìn)行操作。結(jié)果判定：采用半定量法評估陽性細(xì)胞數(shù)及染色強(qiáng)度，陽性細(xì)胞數(shù)≤25%記1分，25%～50%記2分，51%～75%記3分，≥75%為4分；無染色記作0分，染色強(qiáng)記作3分。免疫反應(yīng)評分（immunoreactivity score，IRS）=陽性細(xì)胞數(shù)評分×染色強(qiáng)度評分。IRS評分為0～6分記為Gli1蛋白低表達(dá)，IRS評分＞6分記為Gli1蛋白高表達(dá)。

PR、ER、HER-2檢測方法及陽性判定方法同文獻(xiàn)。

1.4 統(tǒng)計學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，采用GraphPad Prism 6軟件進(jìn)行圖片制作。計數(shù)數(shù)據(jù)用例（%）表示，組間比較行

χ

檢驗(yàn)或校正

χ

檢驗(yàn)。生存分析采用Kaplan Merier分析，組間比較采用Log-rank檢驗(yàn)；采用Cox比例風(fēng)險回歸模型分析病人預(yù)后相關(guān)影響因素，變量篩選采用條件向前法，選入

P

≤0.05，剔除

P

＞0.10變量，檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05，均為雙側(cè)檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 Gli1蛋白在乳腺癌組織及癌旁組織中表達(dá)情況分析

Gli1蛋白主要表達(dá)于細(xì)胞核和細(xì)胞漿中，以細(xì)胞核或細(xì)胞質(zhì)染成黃棕色或黃褐色均勻顆粒狀為陽性。乳腺癌組織Gli1高表達(dá)率45.59%（31/68）高于癌旁組織Gli1高表達(dá)率13.33%（4/30），

χ

值=9.433，

P

=0.002，差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2.2 Gli1蛋白與Luminal型乳腺癌病理特征關(guān)系

Gli1蛋白高表達(dá)與Luminal型乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)（

P

＜0.05），見表1。

表1 Gli1蛋白與Luminal型乳腺癌病理特征關(guān)系

2.3 Gli1表達(dá)與Luminal型乳腺癌預(yù)后關(guān)系

所有病例均獲得隨訪，隨訪截止時間為2018年7月，隨訪時間范圍為6～60個月，中位隨訪時間為38個月；Gli1高表達(dá)5年復(fù)發(fā)人數(shù)為10人，無復(fù)發(fā)生存率為67.74%（21/31），Gli1低表達(dá)5年復(fù)發(fā)人數(shù)為4人，無復(fù)發(fā)生存率為89.19%（33/37），組間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05），見圖1。

圖1 膠質(zhì)瘤相關(guān)癌基因蛋白-1（Gli1）表達(dá)情況與Luminal型乳腺癌無復(fù)發(fā)生存分析

2.4 影響Luminal型乳腺癌預(yù)后的COX回歸分析

經(jīng)COX單因素和多因素分析顯示，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Gli1高表達(dá)是影響Luminal型乳腺癌無復(fù)發(fā)生存時間的獨(dú)立危險因素（

P

＜0.05），見表2。

表2 影響Luminal型乳腺癌預(yù)后的COX回歸分析

3 討論

乳腺癌發(fā)病原因復(fù)雜，可能與環(huán)境因素、遺傳因素、雌激素長期刺激等有關(guān)，發(fā)病機(jī)制尚未明確。有研究顯示，Hedgehog信號通路活化可能是引起乳腺癌發(fā)生的機(jī)制之一，在乳腺癌組織中發(fā)現(xiàn)Hedgehog信號通路相關(guān)分子的異常表達(dá)。Hedge-hog信號通路在胚胎細(xì)胞生長分化過程中起到調(diào)控作用，當(dāng)該通路失活時，相關(guān)蛋白異常表達(dá)，從而引起腫瘤發(fā)生發(fā)展。Hedgehog信號通路主要包括Hh信號分子、信號分子受體Patched1（Ptc1）、GPCR類膜蛋白Smoothened（Smo）及轉(zhuǎn)錄因子Gli，Hedgehog蛋白通過與Ptc1結(jié)合，釋放Smo蛋白，抑制Gli蛋白水解，未水解的Gli蛋白進(jìn)入細(xì)胞核，促進(jìn)原癌基因、細(xì)胞周期蛋白等靶基因轉(zhuǎn)錄，同時Gli蛋白還可進(jìn)一步促進(jìn)Hedgehog蛋白轉(zhuǎn)錄，具有正反饋調(diào)節(jié)作用，不斷激活Hedgehog信號通路，使腫瘤惡化。由此可見，Gli蛋白是Hedgehog信號通路中直接作用于靶基因，反應(yīng)Hedgehog信號通路活化情況的關(guān)鍵蛋白。

Neelakantan等研究發(fā)現(xiàn)，在人類乳腺癌中，上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化與激活的Hedgehog信號通路密切相關(guān)，且Gli抑制劑能對上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化誘導(dǎo)的Gli激活起作用，引起腫瘤發(fā)生。孟尚文、鄭建云研究顯示，Gli1蛋白陽性表達(dá)是影響乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，可作為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的參考指標(biāo)。但目前關(guān)于Gli1蛋白表達(dá)與Luminal型乳腺癌關(guān)系研究較少，本研究結(jié)果顯示，Luminal型乳腺癌組織中，Gli1蛋白高表達(dá)率明顯高于癌旁組織，且與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，伴有淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者Gli1蛋白高表達(dá)率明顯較高。對Gli1蛋白表達(dá)與Luminal型乳腺癌病人預(yù)后情況分析發(fā)現(xiàn)，Gli1蛋白高表達(dá)者5年無復(fù)發(fā)生存率明顯低于Gli1蛋白低表達(dá)者，并且是影響Luminal型乳腺癌預(yù)后的獨(dú)立危險因素，提示Gli1蛋白高表達(dá)預(yù)示著Luminal型乳腺癌早期轉(zhuǎn)移復(fù)發(fā)。

Gli1誘導(dǎo)腫瘤發(fā)生的機(jī)制可能如下：（1）Gli1可直接誘導(dǎo)Bcl-2表達(dá)，抑制癌細(xì)胞凋亡；（2）Gli1可促進(jìn)細(xì)胞周期蛋白表達(dá)，調(diào)控細(xì)胞周期，促進(jìn)癌細(xì)胞增殖；（3）Gli1可直接促進(jìn)上皮細(xì)胞-間充質(zhì)轉(zhuǎn)化發(fā)生，增強(qiáng)癌細(xì)胞侵襲能力。丁斌等研究發(fā)現(xiàn)環(huán)杷明作為Hedgehog信號通路抑制劑，處理人乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231后，Gli1蛋白和Bcl-2蛋白表達(dá)量明顯降低，癌細(xì)胞增殖受到抑制，凋亡率升高，認(rèn)為Gli1可能成為乳腺癌治療的潛在靶點(diǎn)。Oladapo等采用不同Gli拮抗劑處理乳腺癌細(xì)胞，結(jié)果發(fā)現(xiàn)Gli拮抗劑均顯著下調(diào)了細(xì)胞周期素Cyclin D、Cyclin E等細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，降低了癌細(xì)胞生長速度，認(rèn)為Gli1的激活在促進(jìn)細(xì)胞增殖、運(yùn)動、腫瘤生長中起到重要作用，而Gli1拮抗劑可將此過程逆轉(zhuǎn)。

綜上所述，Luminal型乳腺癌組織中Gli1表達(dá)上調(diào)，高表達(dá)Gli1與Luminal型乳腺癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，且是Luminal型乳腺癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移的獨(dú)立危險因素，對預(yù)后具有一定評估價值，同時也可成為臨床治療乳腺癌的潛在靶點(diǎn)。