卿海輝,張小舟,胡敏,賀茂林
隨著分子生物學(xué)的發(fā)展,分子靶向治療給骨肉瘤的治療帶來了新的希望。研究發(fā)現(xiàn)miRNA影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展;miR-301b通過靶向頭帕腫瘤綜合征蛋白(Cylindromatosis,CYLD)促進三陰性乳腺癌細胞增殖;miR-301b在骨肉瘤腫瘤組織與外周血中上調(diào)表達。但miR-301b-3p其對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制尚不清楚。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN)是一個抑癌基因,參與調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的多條通路,其異常表達與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān),PTEN能作為惡性腫瘤治療中的潛在靶點。有研究報道PTEN基因啟動子高甲基化導(dǎo)致的PTEN基因失活可能參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。DJ-1又名帕金森病蛋白7(PARK7),其可通過增加PTEN表達影響骨肉瘤細胞的惡性生物學(xué)行為。但miR-301b-3p是否通過PTEN影響骨肉瘤細胞的增殖、凋亡還尚未清楚。本研究在2019年3—9月開展,旨在確定miR-301b-3p對骨肉瘤細胞的影響及其機制是否與PTEN相關(guān)。
1.1 材料與試劑
人成骨細胞(hFOB)和骨肉瘤細胞U2OS、MG63購自美國菌種保藏中心;杜爾伯格氏伊戈爾培養(yǎng)基(DMEM)購自美國Gibico;四甲基偶氮唑鹽(MTT)試劑盒購自美國Sigma;Trizol、熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen;雙熒光素酶檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。1.2 方法
1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組人成骨細胞hFOB和骨肉瘤細胞U2OS、MG63用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng),取對數(shù)生長期細胞U2OS,將miRNA抑制物陰性對照(anti-miR-NC)、miR-301b-3p抑制物(anti-miR-301b-3p)轉(zhuǎn)染至U2OS細胞中,記為anti-miR-NC組、anti-miR-301b-3p組;將anti-miR-301b-3p分別與小干擾RNA陰性對照(si-NC)、PTEN小干擾RNA(si-PTEN)共轉(zhuǎn)染至U2OS細胞,記為anti-miR-301b-3p+si-NC組、anti-miR-301b-3p+si-PTEN組。
1.2.2 實時熒光定量PCR(RT-qPCR)檢測miR-301b-3p表達水平提取hFOB細胞、骨肉瘤細胞U2OS、MG63及各組U2OS細胞的總RNA,合成cDNA后進行PCR,相對表達量用2法計算。
1.2.3 MTT檢測細胞活性各組U2OS細胞培養(yǎng)48 h,按試劑盒說明操作,酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度(OD)值。
1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡收集各組U2OS細胞,按試劑盒說明操作,最后上流式細胞儀檢測并分析凋亡情況。
1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達水平提取總蛋白,進行電泳分離蛋白,然后轉(zhuǎn)至PVDF,封閉后加入細胞周期蛋白D1(Cyclin D1)、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑(P21)、B細胞淋巴瘤-2(Bcl-2)、Bcl相關(guān)X蛋白(Bax)、PTEN等一抗4℃孵育過夜;洗膜后加入二抗室溫孵育2 h,顯影,定影,測各條帶吸光度值。
1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測miR-301b-3p對PTEN的靶向調(diào)控將PTEN野生型熒光素酶報告載體(WT-PTEN)和PTEN突變型熒光素酶報告載體(MUT-PTEN)分別與miR-NC和miR-301b-3p共轉(zhuǎn)染至U2OS細胞,按說明書操作檢測U2OS細胞的熒光素酶活性。將anti-miR-NC、anti-miR-301b-3p、miRNC、miR-301b-3p分別轉(zhuǎn)染至U2OS細胞中,蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN蛋白表達水平。
2.1 miR-301b-3p在人成骨細胞hFOB和骨肉瘤細胞U2OS、MG63中的表達
與人成骨細胞hFOB相比,骨肉瘤細胞U2OS、MG63中miR-301b-3p表達水平 顯 著 升 高[(0.89±0.09),(0.70±0.07)比(0.20±0.02),F=
255.963,P
<0.05]。2.2 抑制miR-301b-3p表達對細胞U2OS增殖、凋亡的影響
細胞活性在不同組間、不同時間點間、組間×?xí)r間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義(F
=83.774,P
<0.001;F
=65.178,P
<0.001;F
=63.286,P
<0.001);轉(zhuǎn)染anti-miR-301b-3p的U2OS細胞相較于anti-miR-NC,miR-301b-3p表達水平顯著降低,U2OS細胞的活性以及Cyclin D1、Bcl-2表達水平降低,而凋亡率以及P21、Bax表達水平顯著升高(P
<0.05)(圖1,表1,表2)。表1 抑制miR-301b-3p表達對U2OS增殖、凋亡蛋白表達的影響/±s
表2 抑制miR-301b-3p表達對U2OS增殖、凋亡的影響/±s
圖1 抑制miR-301b-3p表達對骨肉瘤細胞(U2OS)增殖、凋亡的影響:A為抑制miR-301b-3p表達后U2OS細胞凋亡;B為抑制miR-301b-3p表達后相關(guān)蛋白表達
可見,抑制miR-301b-3p表達抑制細胞U2OS增殖、促進凋亡。
2.3 miR-301b-3p靶向、調(diào)控PTEN
starBase軟件預(yù)測到PTEN與miR-301b-3p存在結(jié)合位點(圖2A)。miR-301b-3p與WT-PTEN轉(zhuǎn)染后細胞U2OS的熒光素酶活性顯著降低(P
<0.05)(表3)。過表達miR-301b-3p可降低PTEN表達水平[(0.10±0.01)比(0.36±0.03),t
=24.666,P
<0.05];而抑制miR-301b-3p表達可提高PTEN表達水平[(0.69±0.07)比(0.35±0.03),t
=13.393,P
<0.05](圖2B)??梢?,miR-301b-3p可靶向調(diào)控PTEN的表達。表3 雙熒光素酶報告實驗/±s
圖2 miR-301b-3p靶向調(diào)控第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物(PTEN):A為PTEN與miR-301b-3p的互補序列;B為PTEN蛋白表達
2.4 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對細胞U2OS增殖的抑制作用
與anti-miR-301b-3p+si-NC組相比,anti-miR-301b-3p+si-PTEN組PTEN、P21表達水平顯著降低,Cyclin D1表達水平和細胞活性顯著升高(P
<0.05)(圖3,表4)??梢?,抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對細胞U2OS增殖的抑制作用。表4 抑制PTEN和miR-301b-3p表達對U2OS增殖的影響/±s
圖3 抑制PTEN和miR-301b-3p表達對骨肉瘤細胞增殖蛋白表達的影響
2.5 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p表達對細胞U2OS凋亡的促進作用
與anti-miR-301b-3p+si-NC組相比,anti-miR-301b-3p+si-PTEN組Bcl-2表達水平升高,而Bax表達水平和細胞凋亡率降低(P
<0.05)(圖4,表5)??梢?,抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對U2OS細胞凋亡的作用。表5 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對骨肉瘤細胞凋亡的影響/±s
圖4 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p表達對骨肉瘤細胞凋亡蛋白表達的影響
骨肉瘤具有侵襲性強、惡性程度高、進展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點,嚴(yán)重威脅人類的健康,亟需新的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)miR-301b在肝癌細胞中高表達,可通過抑制Kruppel樣因子4(Kruppellike Factor 4,KLF4)的表達促進肝癌的遷移。miR-301b-3p通過靶向作用于MYB與CYLD促進巨噬細胞刺激因子誘導(dǎo)的單核細胞自噬。以上結(jié)果表明miR-301b-3p參與調(diào)節(jié)腫瘤的進展,還有研究用miRNA表達譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-301a-3p在人骨肉瘤細胞系中上調(diào)表達。本研究通過檢測骨肉瘤細胞和正常細胞中miR-301a-3p的表達水平,發(fā)現(xiàn)miR-301b-3p在骨肉瘤細胞中表達水平顯著升高,與文獻研究結(jié)果相符。為進一步了解miR-301a-3p對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響,本研究轉(zhuǎn)染miR-301a-3p抑制表達載體,結(jié)果顯示,骨肉瘤U2OS細胞的活性降低,而凋亡率升高;說明抑制miR-301b-3p表達抑制U2OS細胞增殖,促進細胞凋亡。此外,抑制miR-301b-3p表達可提高p21、Bax表達水平,降低CyclinD1、Bcl-2表達水平;進一步說明抑制miR-301b-3p表達可抑制U2OS細胞的惡性增殖,促進細胞凋亡。
研究發(fā)現(xiàn),PTEN在骨肉瘤細胞中高表達,PTEN可通過提高半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶(cysteinyl aspartate specific proteinase,caspase)-3、caspase-7、caspase-9活性,誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細胞凋亡。說明PTEN影響骨肉瘤的發(fā)展,與骨肉瘤的進展有關(guān)。還有研究報道PTEN可作為靶基因被miRNA調(diào)控而影響腫瘤的進展。如過表達miR-155可通過負調(diào)控PTEN,增強磷脂酰肌醇激酶(PI3K)通路信號,從而促進肝癌細胞的增殖和遷移。miR-365通過靶向PTEN抑制結(jié)腸癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。miR-214-3p通過靶向PTEN,活化蛋白激酶B(Protein kinase B,AKT)通路,抑制骨肉瘤細胞的凋亡。然而,miR-301b-3p是否靶向PTEN及是否通過調(diào)控PTEN影響骨肉瘤的進展還尚未可知,本研究通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測到PTEN與miR-301b-3p存在結(jié)合位點。進一步的熒光素酶報告實驗證實miR-301b-3p可靶向調(diào)控PTEN的表達;且同時抑制PTEN和miR-301b-3p表達后,U2OS細胞活性顯著升高,而U2OS細胞凋亡率顯著降低;說明抑制PTEN表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-301b-3p對細胞U2OS增殖的抑制和凋亡促進作用。提示,miR-301b-3p可能通過調(diào)控PTEN影響骨肉瘤細胞增殖和凋亡。
綜上所述,抑制miR-301b-3p表達可能通過調(diào)控PTEN抑制骨肉瘤細胞增殖,促進細胞凋亡。