微小RNA-301b-3p靶向第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響

卿海輝，張小舟，胡敏，賀茂林

隨著分子生物學(xué)的發(fā)展，分子靶向治療給骨肉瘤的治療帶來了新的希望。研究發(fā)現(xiàn)miRNA影響惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展；miR-301b通過靶向頭帕腫瘤綜合征蛋白（Cylindromatosis，CYLD）促進三陰性乳腺癌細胞增殖；miR-301b在骨肉瘤腫瘤組織與外周血中上調(diào)表達。但miR-301b-3p其對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響及其作用機制尚不清楚。第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）是一個抑癌基因，參與調(diào)節(jié)細胞增殖和凋亡的多條通路，其異常表達與惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展相關(guān)，PTEN能作為惡性腫瘤治療中的潛在靶點。有研究報道PTEN基因啟動子高甲基化導(dǎo)致的PTEN基因失活可能參與了骨肉瘤的發(fā)生、發(fā)展。DJ-1又名帕金森病蛋白7（PARK7），其可通過增加PTEN表達影響骨肉瘤細胞的惡性生物學(xué)行為。但miR-301b-3p是否通過PTEN影響骨肉瘤細胞的增殖、凋亡還尚未清楚。本研究在2019年3—9月開展，旨在確定miR-301b-3p對骨肉瘤細胞的影響及其機制是否與PTEN相關(guān)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人成骨細胞（hFOB）和骨肉瘤細胞U2OS、MG63購自美國菌種保藏中心；杜爾伯格氏伊戈爾培養(yǎng)基（DMEM）購自美國Gibico；四甲基偶氮唑鹽（MTT）試劑盒購自美國Sigma；Trizol、熒光定量試劑盒購自美國Invitrogen；雙熒光素酶檢測試劑盒、凋亡檢測試劑盒購自北京Solarbio公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)與分組人成骨細胞hFOB和骨肉瘤細胞U2OS、MG63用DMEM培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)，取對數(shù)生長期細胞U2OS，將miRNA抑制物陰性對照（anti-miR-NC）、miR-301b-3p抑制物（anti-miR-301b-3p）轉(zhuǎn)染至U2OS細胞中，記為anti-miR-NC組、anti-miR-301b-3p組；將anti-miR-301b-3p分別與小干擾RNA陰性對照（si-NC）、PTEN小干擾RNA（si-PTEN）共轉(zhuǎn)染至U2OS細胞，記為anti-miR-301b-3p+si-NC組、anti-miR-301b-3p+si-PTEN組。

1.2.2 實時熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測miR-301b-3p表達水平提取hFOB細胞、骨肉瘤細胞U2OS、MG63及各組U2OS細胞的總RNA，合成cDNA后進行PCR，相對表達量用2法計算。

1.2.3 MTT檢測細胞活性各組U2OS細胞培養(yǎng)48 h，按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.4 流式細胞儀檢測細胞凋亡收集各組U2OS細胞，按試劑盒說明操作，最后上流式細胞儀檢測并分析凋亡情況。

1.2.5 蛋白質(zhì)印跡法檢測蛋白表達水平提取總蛋白，進行電泳分離蛋白，然后轉(zhuǎn)至PVDF，封閉后加入細胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑（P21）、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl相關(guān)X蛋白（Bax）、PTEN等一抗4℃孵育過夜；洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，測各條帶吸光度值。

1.2.6 熒光素酶報告實驗檢測miR-301b-3p對PTEN的靶向調(diào)控將PTEN野生型熒光素酶報告載體（WT-PTEN）和PTEN突變型熒光素酶報告載體（MUT-PTEN）分別與miR-NC和miR-301b-3p共轉(zhuǎn)染至U2OS細胞，按說明書操作檢測U2OS細胞的熒光素酶活性。將anti-miR-NC、anti-miR-301b-3p、miRNC、miR-301b-3p分別轉(zhuǎn)染至U2OS細胞中，蛋白質(zhì)印跡法檢測PTEN蛋白表達水平。

2 結(jié)果

2.1 miR-301b-3p在人成骨細胞hFOB和骨肉瘤細胞U2OS、MG63中的表達

與人成骨細胞hFOB相比，骨肉瘤細胞U2OS、MG63中miR-301b-3p表達水平 顯 著 升 高［（0.89±0.09），（0.70±0.07）比（0.20±0.02），

F=

255.963，

P

＜0.05］。

2.2 抑制miR-301b-3p表達對細胞U2OS增殖、凋亡的影響

細胞活性在不同組間、不同時間點間、組間×?xí)r間均差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

F

=83.774，

P

＜0.001；

F

=65.178，

P

＜0.001；

F

=63.286，

P

＜0.001）；轉(zhuǎn)染anti-miR-301b-3p的U2OS細胞相較于anti-miR-NC，miR-301b-3p表達水平顯著降低，U2OS細胞的活性以及Cyclin D1、Bcl-2表達水平降低，而凋亡率以及P21、Bax表達水平顯著升高（

P

＜0.05）（圖1，表1，表2）。

表1 抑制miR-301b-3p表達對U2OS增殖、凋亡蛋白表達的影響/±s

表2 抑制miR-301b-3p表達對U2OS增殖、凋亡的影響/±s

圖1 抑制miR-301b-3p表達對骨肉瘤細胞（U2OS）增殖、凋亡的影響：A為抑制miR-301b-3p表達后U2OS細胞凋亡；B為抑制miR-301b-3p表達后相關(guān)蛋白表達

可見，抑制miR-301b-3p表達抑制細胞U2OS增殖、促進凋亡。

2.3 miR-301b-3p靶向、調(diào)控PTEN

starBase軟件預(yù)測到PTEN與miR-301b-3p存在結(jié)合位點（圖2A）。miR-301b-3p與WT-PTEN轉(zhuǎn)染后細胞U2OS的熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05）（表3）。過表達miR-301b-3p可降低PTEN表達水平［（0.10±0.01）比（0.36±0.03），

t

=24.666，

P

＜0.05］；而抑制miR-301b-3p表達可提高PTEN表達水平［（0.69±0.07）比（0.35±0.03），

t

=13.393，

P

＜0.05］（圖2B）?？梢?，miR-301b-3p可靶向調(diào)控PTEN的表達。

表3 雙熒光素酶報告實驗/±s

圖2 miR-301b-3p靶向調(diào)控第10號染色體缺失的磷酸酶及張力蛋白同源物（PTEN）：A為PTEN與miR-301b-3p的互補序列；B為PTEN蛋白表達

2.4 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對細胞U2OS增殖的抑制作用

與anti-miR-301b-3p+si-NC組相比，anti-miR-301b-3p+si-PTEN組PTEN、P21表達水平顯著降低，Cyclin D1表達水平和細胞活性顯著升高（

P

＜0.05）（圖3，表4）?？梢?，抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對細胞U2OS增殖的抑制作用。

表4 抑制PTEN和miR-301b-3p表達對U2OS增殖的影響/±s

圖3 抑制PTEN和miR-301b-3p表達對骨肉瘤細胞增殖蛋白表達的影響

2.5 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p表達對細胞U2OS凋亡的促進作用

與anti-miR-301b-3p+si-NC組相比，anti-miR-301b-3p+si-PTEN組Bcl-2表達水平升高，而Bax表達水平和細胞凋亡率降低（

P

＜0.05）（圖4，表5）?？梢?，抑制PTEN能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對U2OS細胞凋亡的作用。

表5 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p對骨肉瘤細胞凋亡的影響/±s

圖4 抑制PTEN表達能逆轉(zhuǎn)抑制miR-301b-3p表達對骨肉瘤細胞凋亡蛋白表達的影響

3 討論

骨肉瘤具有侵襲性強、惡性程度高、進展快、轉(zhuǎn)移早、預(yù)后差、易復(fù)發(fā)等特點，嚴(yán)重威脅人類的健康，亟需新的治療方法。研究發(fā)現(xiàn)miR-301b在肝癌細胞中高表達，可通過抑制Kruppel樣因子4（Kruppellike Factor 4，KLF4）的表達促進肝癌的遷移。miR-301b-3p通過靶向作用于MYB與CYLD促進巨噬細胞刺激因子誘導(dǎo)的單核細胞自噬。以上結(jié)果表明miR-301b-3p參與調(diào)節(jié)腫瘤的進展，還有研究用miRNA表達譜芯片檢測發(fā)現(xiàn)miR-301a-3p在人骨肉瘤細胞系中上調(diào)表達。本研究通過檢測骨肉瘤細胞和正常細胞中miR-301a-3p的表達水平，發(fā)現(xiàn)miR-301b-3p在骨肉瘤細胞中表達水平顯著升高，與文獻研究結(jié)果相符。為進一步了解miR-301a-3p對骨肉瘤細胞增殖、凋亡的影響，本研究轉(zhuǎn)染miR-301a-3p抑制表達載體，結(jié)果顯示，骨肉瘤U2OS細胞的活性降低，而凋亡率升高；說明抑制miR-301b-3p表達抑制U2OS細胞增殖，促進細胞凋亡。此外，抑制miR-301b-3p表達可提高p21、Bax表達水平，降低CyclinD1、Bcl-2表達水平；進一步說明抑制miR-301b-3p表達可抑制U2OS細胞的惡性增殖，促進細胞凋亡。

研究發(fā)現(xiàn)，PTEN在骨肉瘤細胞中高表達，PTEN可通過提高半胱氨酸天冬氨酸蛋白水解酶（cysteinyl aspartate specific proteinase，caspase）-3、caspase-7、caspase-9活性，誘導(dǎo)人骨肉瘤MG-63細胞凋亡。說明PTEN影響骨肉瘤的發(fā)展，與骨肉瘤的進展有關(guān)。還有研究報道PTEN可作為靶基因被miRNA調(diào)控而影響腫瘤的進展。如過表達miR-155可通過負調(diào)控PTEN，增強磷脂酰肌醇激酶（PI3K）通路信號，從而促進肝癌細胞的增殖和遷移。miR-365通過靶向PTEN抑制結(jié)腸癌細胞的增殖并誘導(dǎo)其凋亡。miR-214-3p通過靶向PTEN，活化蛋白激酶B（Protein kinase B，AKT）通路，抑制骨肉瘤細胞的凋亡。然而，miR-301b-3p是否靶向PTEN及是否通過調(diào)控PTEN影響骨肉瘤的進展還尚未可知，本研究通過starBase數(shù)據(jù)庫預(yù)測到PTEN與miR-301b-3p存在結(jié)合位點。進一步的熒光素酶報告實驗證實miR-301b-3p可靶向調(diào)控PTEN的表達；且同時抑制PTEN和miR-301b-3p表達后，U2OS細胞活性顯著升高，而U2OS細胞凋亡率顯著降低；說明抑制PTEN表達逆轉(zhuǎn)了抑制miR-301b-3p對細胞U2OS增殖的抑制和凋亡促進作用。提示，miR-301b-3p可能通過調(diào)控PTEN影響骨肉瘤細胞增殖和凋亡。

綜上所述，抑制miR-301b-3p表達可能通過調(diào)控PTEN抑制骨肉瘤細胞增殖，促進細胞凋亡。