2型人類表皮生長(zhǎng)因子受體基因?qū)Y(jié)直腸癌自然殺傷細(xì)胞92局部浸潤(rùn)的影響及機(jī)制

譚定春，秦惠何

結(jié)直腸癌是常見(jiàn)的惡性腫瘤之一，近些年的發(fā)病率和死亡率均呈現(xiàn)上升趨勢(shì)，嚴(yán)重威脅人類的生命健康。腫瘤的發(fā)生發(fā)展受腫瘤微環(huán)境中多種因素的調(diào)控，這些因素包括細(xì)胞內(nèi)源性因子和外源性因素，如局部浸潤(rùn)的免疫細(xì)胞、腫瘤細(xì)胞分泌的促炎因子等。淋巴細(xì)胞是腫瘤微環(huán)境的重要組成成分，影響腫瘤的進(jìn)展和預(yù)后，自然殺傷細(xì)胞（NK）是固有免疫細(xì)胞之一。結(jié)腸癌腫瘤組織中NK細(xì)胞數(shù)明顯低于臨近的正常組織，這說(shuō)明腫瘤微環(huán)境中的調(diào)控因子不足以將NK細(xì)胞募集到腫瘤組織。2型人類表皮生長(zhǎng)因子受體（HER2）是人類癌基因之一，在成人組織中幾乎不表達(dá)，而在多種腫瘤中呈現(xiàn)高表達(dá)。有研究顯示，結(jié)直腸癌中HER2表達(dá)升高，RNA干擾HER2表達(dá)可抑制癌細(xì)胞增殖；NK-92細(xì)胞聯(lián)合靶向HER2基因的siRNA可抑制卵巢癌細(xì)胞在體內(nèi)及體外增殖，提示HER2可能在NK細(xì)胞的局部浸潤(rùn)中發(fā)揮調(diào)控作用。NK92細(xì)胞與NK細(xì)胞具有相似的表面分子特征和功能特點(diǎn)，是一種理想的腫瘤生物治療的細(xì)胞系。王洋研究顯示，半乳糖凝集素-9（galectin-9）基因可通過(guò)影響NK92細(xì)胞F-肌動(dòng)蛋白（F-actind）的極化，調(diào)節(jié)NK92細(xì)胞的趨化引動(dòng)。目前，HER2對(duì)NK細(xì)胞局部浸潤(rùn)的影響還未知。鑒于此，本研究于2018年5—11月進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，旨在探討HER2對(duì)結(jié)直腸癌NK細(xì)胞局部浸潤(rùn)的影響及作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

杜爾伯格伊戈?duì)柵囵B(yǎng)基（DMEM）、胎牛血清（FBS）均購(gòu)自美國(guó)Gibco；HER2和β-連環(huán)蛋白（β-catenin）抗體均購(gòu)自美國(guó)CST；重組HER2購(gòu)自美國(guó)R&D；二喹啉甲酸（BCA）試劑盒購(gòu)自中國(guó)碧云天；凝膠成像系統(tǒng)購(gòu)自美國(guó)伯樂(lè)。

1.2 細(xì)胞及培養(yǎng)

人正常結(jié)腸上皮細(xì)胞（NCM460），人 結(jié) 直 腸 癌 細(xì) 胞（SW480、SW620、HT29）及人類NK92細(xì)胞均購(gòu)自美國(guó)ATCC。NCM460、SW480、SW620和HT29細(xì)胞使用含10%FBS的DMEM培養(yǎng)基，NK92細(xì)胞用α最小必需培養(yǎng)基（α-MEM）完全培養(yǎng)基（含2 mmol L-谷氨酰胺、1.5 g/L碳酸氫鈉、12.5%FBS和馬血清、0.02 mmol葉酸、0.2 mmol肌醇、100～200 U/mL重組IL-2和0.1 mmol 2-巰基乙醇），所有細(xì)胞均在5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.3 Western blotting

預(yù)冷RIPA裂解液（加蛋白酶抑制劑PMSF）提取生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的SW480、SW620和HT29細(xì)胞總蛋白，BCA試劑盒定量蛋白，蛋白變性后，每孔加40 μg上樣，依次經(jīng)10%SDSPAGE、轉(zhuǎn)PVDF膜，5%脫脂奶粉封閉，洗膜，將膜完全浸入按照1∶500稀釋的HER2及1∶1 000稀釋的內(nèi)參GAPDH溶液中，4℃搖床孵育過(guò)夜，洗膜，加1∶2 000稀釋的HRP標(biāo)記的二抗，室溫孵育30～50 min，洗膜，ECL顯色，顯影、定影，待膠片晾干后掃描分析。使用Image J分析軟件對(duì)圖像進(jìn)行灰度值分析。得出目的蛋白與內(nèi)參蛋白光密度值比值，即為蛋白的相對(duì)表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.4 轉(zhuǎn)染

以1×10/孔接種生長(zhǎng)至對(duì)數(shù)期的HT29細(xì)胞于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔2 mL，使其在24 h內(nèi)細(xì)胞達(dá)70%～80%生長(zhǎng)匯合度，參照Lipofectamine2000說(shuō)明制備Lipo-2000-siRNA復(fù)合物，其中siRNA包括陰性對(duì)照siRNA及HER2的特異性siRNA，將復(fù)合物加入培養(yǎng)孔中，設(shè)置加等體積脂質(zhì)體的空白組，輕輕混勻，37℃、5%二氧化碳、飽和濕度培養(yǎng)箱，常規(guī)孵育4～6 h，更換含血清及雙抗的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48 h，然后進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。siRNA序列如下：HER2 siRNA正向引物5'-CUGGUGUAUGCAGAUUGCCUU-3'，反向引物5'-GGCAAUCUGCAUACACCAGUU-3'；陰 性 對(duì) 照siRNA正 向 引 物5'-CUUGUAUGGGCAGAUUGCCUU-3'，反向引物5'-GGCAAUCUGCCCAUACAAGUU-3'。

1.5 HT29細(xì)胞培養(yǎng)上清HER2的含量

HER2的特異性siRNA轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞48 h，收集腫瘤細(xì)胞培養(yǎng)上清，采用ELISA試劑盒檢測(cè)上清中HER2的含量。

1.6 趨化實(shí)驗(yàn)

將100 μL的NK92細(xì)胞（濃度2×10/mL）置于Transwell小室上層，Transwell小室下層加25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的rhHER2或600 μL的HT29細(xì)胞培養(yǎng)上清，將培養(yǎng)板放于37℃孵箱中4 h，用于趨化實(shí)驗(yàn)。收集下室細(xì)胞使用細(xì)胞計(jì)數(shù)板計(jì)數(shù)。應(yīng)用趨化指數(shù)（MI）評(píng)估：MI=趨化細(xì)胞數(shù)/自發(fā)趨化細(xì)胞數(shù)（無(wú)趨化因子）。此外，使用7.5 ng/mL的IL-12作為NK細(xì)胞趨化作用的陽(yáng)性對(duì)照。

2 結(jié)果

2.1 三株結(jié)直腸癌細(xì)胞HER2基因表達(dá)

以正常結(jié)腸NCM460細(xì)胞為對(duì)照細(xì)胞，Western blotting檢測(cè)結(jié)直腸癌SW480、SW620和HT29細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖1所示。

圖1 SW480、SW620和HT29細(xì)胞HER2的蛋白表達(dá)

三株結(jié)直腸癌細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)均明顯高于NCM460細(xì) 胞［（0.104±0.011）、（0.141±0.015）、（0.243±0.018）比（0.018±0.003），

F

=153.526，

P

＜0.05］，由于在HT29細(xì)胞表達(dá)最高，因此選擇HT29細(xì)胞為后續(xù)研究對(duì)象。

2.2 HER2小干擾RNA轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞效果

轉(zhuǎn)染si-HER2的HT29細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)［（0.467±0.046）、（0.506±0.053）比（0.101±0.012），

F

=88.628，

P

＜0.05］及培養(yǎng)上清HER2含量［（74.7±4.6）pg/mL比（125.3±10.1）pg/mL、（121.6±9.3）pg/mL，

F

=34.153，

P

＜0.05］均明顯低于對(duì)照組和NC組。見(jiàn)圖2。

圖2 Western blotting檢測(cè)轉(zhuǎn)染si-HER2的HT29細(xì)胞HER2蛋白表達(dá)

2.3 重組HER2對(duì)NK92細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的影響

25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的重組HER2處理NK92細(xì)胞4 h，IL-12作為陽(yáng)性對(duì)照，細(xì)胞趨化檢測(cè)結(jié)果顯示，與對(duì)照組比較，IL-12組遷移指數(shù)明顯升高［（1.00±0.10）比（2.26±0.24），

P

＜0.05］，而100 ng/mL重組HER2組遷移指數(shù)明顯降低［（1.00±0.10）比（0.63±0.09），

P

＜0.05］。25 ng/mL和50 ng/mL的重組HER2組遷移指數(shù)與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（1.00±0.10）比（1.11±0.12）、（1.04±0.15），

P

＞0.05］。

2.4 抑制HER2表達(dá)對(duì)NK92細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)的影響

si-HER2轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后，收集腫瘤上清對(duì)NK92細(xì)胞進(jìn)行趨化實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與對(duì)照組、NC組比較，si-HER2組遷移指數(shù)明顯升高［（1.00±0.11），（1.37±0.10）比（1.95±0.16），

F

=43.264，

P

＜0.05］。

2.5 重組HER2對(duì)NK92細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

25 ng/mL、50 ng/mL和100 ng/mL的重組HER2處理NK92細(xì)胞4 h，IL-12作為陽(yáng)性對(duì)照，Western blotting檢測(cè)NK92細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖3所示。與對(duì)照組比較，IL-12組βcatenin蛋白水平明顯降低［（0.687±0.059）比（0.312±0.025），

P

＜0.05］，而100 ng/mL重 組HER2組βcatenin蛋白水平明顯升高［（0.687±0.059）比（1.118±0.097），

P

＜0.05］。25 ng/mL和50 ng/mL的 重 組HER2組β-catenin蛋白水平與對(duì)照組差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意 義［（0.687±0.059）比（0.692±0.061），（1.118±0.097），

P

＞0.05］。

圖3 各組NK92細(xì)胞β-catenin蛋白表達(dá)條帶

2.6 抑制HER2對(duì)NK92細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

si-HER2轉(zhuǎn)染HT29細(xì)胞后，收集腫瘤上清，Western blotting檢測(cè)β-catenin蛋白表達(dá)，結(jié)果如圖4所示，si-HER2組β-catenin蛋白表達(dá)明顯低于對(duì)照組和NC組（0.687±0.059），（0.651±0.052）比（0.092±0.011），

F

=158.849，

P

＜0.05］。

圖4 HER2對(duì)NK92細(xì)胞Wnt/β-catenin信號(hào)通路的影響

3 討論

NK細(xì)胞是固有免疫系統(tǒng)的主要細(xì)胞之一，可識(shí)別和殺傷腫瘤細(xì)胞，在腫瘤的免疫監(jiān)視中起重要作用。研究顯示，結(jié)直腸癌腫瘤組織中淋巴細(xì)胞大量浸潤(rùn)的病人預(yù)后較好，原因與NK細(xì)胞對(duì)腫瘤細(xì)胞的識(shí)別和殺傷作用密不可分。NK92細(xì)胞是一種NK細(xì)胞，與人NK細(xì)胞具有相似的表面分子特征和功能特點(diǎn)，對(duì)血液系統(tǒng)腫瘤、黑素瘤等具有很強(qiáng)的殺傷活性，且不引起自身正常細(xì)胞損傷，是目前認(rèn)為的一種理想的可用于腫瘤生物治療的細(xì)胞系。

HER2是一種由原癌基因表達(dá)的跨膜糖蛋白，可促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲和血管生成，抑制腫瘤細(xì)胞的凋亡。研究顯示，HER2在結(jié)直腸癌組織中的表達(dá)水平明顯高于正常組織，其表達(dá)水平與腫瘤浸潤(rùn)深度密切相關(guān)，可作為判斷結(jié)直腸癌發(fā)生、發(fā)展、浸潤(rùn)及轉(zhuǎn)移的有效生物學(xué)指標(biāo)。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞系中HER2蛋白表達(dá)明顯高于正常結(jié)腸細(xì)胞，與相關(guān)研究結(jié)果一致，提示HER2參與結(jié)直腸癌的發(fā)生和發(fā)展；研究顯示，激活HER2-ERK1/2信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可促進(jìn)乳腺癌MCF-7細(xì)胞的遷移和侵襲；HER2靶向NK細(xì)胞可用于治療HER2陽(yáng)性轉(zhuǎn)移性乳腺癌。本研究結(jié)果顯示，重組HER2可降低NK92細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)，而抑制HER2表達(dá)后NK92細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)明顯升高，說(shuō)明抑制HER2表達(dá)可增強(qiáng)結(jié)直腸癌NK92細(xì)胞趨化運(yùn)動(dòng)。

Wnt/β-catenin是細(xì)胞內(nèi)一條重要的信號(hào)途徑，與多種腫瘤發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究表明，抑制Wnt/β-catenint通路可降低腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)、侵襲、遷移。β-catenin是Wnt/β-catenint信號(hào)的關(guān)鍵分子，研究顯示，NK細(xì)胞對(duì)非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞NCI-H292具有殺傷作用，并可抑制β-catenin蛋白表達(dá)。本研究結(jié)果顯示，HER2表達(dá)受到抑制后，NK92細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)明顯降低，而重組HER2則會(huì)促進(jìn)NK92細(xì)胞中β-catenin蛋白表達(dá)，提示抑制HER2表達(dá)可能通過(guò)下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)通路增強(qiáng)結(jié)直腸癌NK細(xì)胞的趨化運(yùn)動(dòng)，進(jìn)而增加結(jié)直腸癌NK細(xì)胞局部浸潤(rùn)。

綜上所述，抑制HER2基因表達(dá)可增強(qiáng)結(jié)直腸癌NK92細(xì)胞局部浸潤(rùn)，機(jī)制與下調(diào)Wnt/β-catenin信號(hào)有關(guān)。提示HER2可能是結(jié)直腸癌治療的有效靶點(diǎn)之一。