長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA 00963通過(guò)靶向微小RNA-148b-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

任繼兵，陳夢(mèng)琳，李傳斌

結(jié)直腸癌（CRC）是常見(jiàn)的消化道惡性腫瘤之一，靶向治療可有效改善生存率，降低病死率。研究表明異常表達(dá)的長(zhǎng)鏈非編碼RNA（lncRNA）影響了CRC的發(fā)生發(fā)展，并作為結(jié)直腸癌診斷、治療及預(yù)后的靶標(biāo)。長(zhǎng)鏈基因間非編碼RNA 00963（LINC00963）是一種新的長(zhǎng)非編碼RNA，敲低LINC00963可減弱C4-2細(xì)胞的增殖、侵襲能力，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，通過(guò)表皮生長(zhǎng)因子受體（EGFR）信號(hào)通路參與前列腺癌從雄激素依賴向雄激素獨(dú)立的轉(zhuǎn)變。LINC00963在肝癌細(xì)胞中上調(diào)，其通過(guò)激活磷脂酰肌醇3激酶/蛋白激酶B（PI3K/AKT）途徑和促進(jìn)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖能力顯著延長(zhǎng)肝細(xì)胞癌細(xì)胞的G0/G1期。復(fù)發(fā)和轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致結(jié)直腸癌病人死亡的重要原因，而上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）在多種類(lèi)型腫瘤的原位浸潤(rùn)和遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移扮演重要角色，研究發(fā)現(xiàn)miRNA可參與調(diào)控EMT轉(zhuǎn)化影響結(jié)直腸癌的侵襲及轉(zhuǎn)移。微小RNA-148b-3p（miR-148b-3p）是miRNA的一種，研究發(fā)現(xiàn)miR-148b-3p在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中低表達(dá)，過(guò)表達(dá)抑制膠質(zhì)瘤增殖和侵襲；此外，微小RNA-148-b（miR-148b）可調(diào)節(jié)垂體腺瘤細(xì)胞的增殖和侵襲。但LINC00963和miR-148b-3p對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖、遷移侵襲的影響還尚未可知。本研究旨在研究LINC00963是否通過(guò)控miR-148b-3p影響結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。本研究于2018年8月至2019年5月進(jìn)行。

1 材料與方法

1.1 材料

正常結(jié)直黏膜上皮細(xì)胞NCM460和結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29、SW480、SW1116購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。RPMI-1640培養(yǎng)基（美國(guó)Gibico）；熒光定量試劑盒（日本TaKaRa公司）；Transwell小室、基質(zhì)膠（美國(guó)BD公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、雙熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)試劑盒（美國(guó)Sigma公司）；放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液（上海碧云天）。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組用RPMI-1640培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)正常結(jié)直黏膜上皮細(xì)胞NCM460和結(jié)直腸癌細(xì)胞株HT29、SW480、SW1116；取生長(zhǎng)至80%融合的HT29細(xì)胞，將LINC00963過(guò)表達(dá)載體陰性對(duì)照（pcDNA）、LINC00963過(guò) 表 達(dá) 載 體（pcDNALINC00963）、LINC00963抑制表達(dá)載體陰性對(duì)照（si-NC）、LINC00963抑制表達(dá)載體（si-LINC00963）、miR-148b-3p模擬物陰性對(duì)照（miR-NC）、miR-148b-3p模擬物（miR-148b-3p）轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞，分別記為pcDNA組、pcDNA-LINC00963組、si-NC組、si-LINC00963組、miR-NC組、miR-148b-3p組；將si-LINC00963分別與miR-148b-3p抑制劑（anti-miR-148b-3p）及陰性對(duì)照（anti-miR-NC）共轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞，記為si-LINC00963+anti-miR-NC組、si-LINC00963+anti-miR-148b-3p組。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2.2 qRT-PCR檢 測(cè)miR-148b-3p和LINC00963表達(dá)水平提取各組細(xì)胞總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，按試劑盒說(shuō)明進(jìn)行PCR，采用2法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。miR-148b-3p引物的正向序列為5′-GGATGTCAGTGCATCACAGAAC-3′，反向序列為5′-CAGTGCGTGTCGTGGAGT-3′；LINC00963引物的正向序列為5′-GGTAAATCGAGGCCCAGAGAT-3′，反 向 序 列 為5′-ACGTGGATGACAGCGTGTGA-3′；U6引物的正向序列為5′-CGCTTCGGCACATATAC-3′，反向序列為5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′；甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物的正向序列為5′-CATGAGAAGTATGACAACAGCCT-3′，反向序列為5′-AGTCCTTCCACGATACCAAAGT-3′。

1.2.3 蛋白質(zhì)印跡法（Western blotting）檢測(cè)蛋白的表達(dá)提取細(xì)胞總蛋白，定量后進(jìn)行SDS-PAGE電泳，轉(zhuǎn)膜、封閉；加入細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、基質(zhì)金屬蛋白酶（MMP）-2、MMP-9等一抗在4℃冰箱孵育過(guò)夜，洗膜后加入二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，分析蛋白條帶吸光度值。

1.2.4 MTT檢測(cè)細(xì)胞增殖各組HT29細(xì)胞分別培養(yǎng)24 h、48 h、72 h，按試劑盒說(shuō)明操作，酶標(biāo)儀檢測(cè)490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell檢測(cè)細(xì)胞遷移和侵襲將無(wú)血清培養(yǎng)基重懸的細(xì)胞接種于Transwell上室，培養(yǎng)24 h，用結(jié)晶紫染色細(xì)胞，顯微鏡下隨機(jī)選取5個(gè)計(jì)數(shù)，取均值。侵襲實(shí)驗(yàn)：用基質(zhì)膠覆蓋Transwell上室，其余同遷移操作。

1.2.6雙熒光素酶報(bào)告基因?qū)嶒?yàn)將LINC00963野生型報(bào)告質(zhì)粒（WT-LINC00963）和突變型報(bào)告質(zhì)粒（MUTLINC00963）分別miR-NC和miR-148b-3p與轉(zhuǎn)染至HT29細(xì)胞，按試劑盒說(shuō)明操作，檢測(cè)熒光素酶活性。

2 結(jié)果

2.1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中LINC00963和miR-148b-3p的表達(dá)

結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、SW480、SW1116中LINC00963的表達(dá)水平高于NCM460細(xì)胞，而miR-148b-3p的 表 達(dá) 水 平低 于NCM460細(xì) 胞（

P

＜0.05），見(jiàn)表1。選擇表達(dá)變化最明顯的HT29細(xì)胞用作后續(xù)試驗(yàn)。

表1 LINC00963和miR-148b-3p在結(jié)直腸癌細(xì)胞中的表達(dá)/±s

2.2 LINC00963靶向調(diào)控miR-148b-3p的表達(dá)

LINC00963與miR-148b-3p有 結(jié) 合 位 點(diǎn)（圖1）。miR-148b-3p與WT-LINC00963共轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05）；而miR-148b-3p與MUT-LINC00963共轉(zhuǎn)染的HT29細(xì)胞熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（表2）。pcDNA-LINC00963組miR-148b-3p的表達(dá)水平低于pcDNA組；si-LINC00963組miR-148b-3p的表達(dá)水平高于si-NC組（

P

＜0.05）（表3）?？梢?jiàn)，LINC00963可靶向調(diào)控miR-148b-3p的表達(dá)。

表2 HT29細(xì)胞熒光素酶活性/±s

表3 LINC00963調(diào)控miR-148b-3p的表達(dá)/±s

圖1 LINC00963與miR-148b-3p的互補(bǔ)核苷酸序列

2.3 干擾LINC00963對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與si-NC組相比，si-LINC00963組LINC00963表達(dá)水平，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平降低，p21表達(dá)水平升高，HT29細(xì)胞活性及遷移侵襲數(shù)量降低（

P

＜0.05）（圖2，表4）?？梢?jiàn)，干擾LINC00963表達(dá)抑制結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

表4 干擾LINC00963對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

圖2 干擾LINC00963對(duì)HT29細(xì)胞遷移侵襲和相關(guān)蛋白表達(dá)的影響：A為Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)；B為HT29細(xì)胞遷移侵襲數(shù)（結(jié)晶紫染色×200倍）

2.4 miR-148b-3p過(guò)表達(dá)對(duì)結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響

與miR-NC組相比，miR-148b-3p組miR-148b-3p表達(dá)水平升高，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平降低，p21表達(dá)水平升高，HT29細(xì)胞活性及遷移侵襲數(shù)量降低（

P

＜0.05）（圖3，表5）。可見(jiàn)，miR-148b-3p過(guò)表達(dá)抑制結(jié)直腸癌HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

表5 miR-148b-3p過(guò)表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的影響/±s

圖3 Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白表達(dá)

2.5 抑制miR-148b-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾LINC00963表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用

與si-LINC00963+anti-miR-NC組相比，si-LINC00963+anti-miR-148b-3p組miR-148b-3p的 表達(dá)水平降低，Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平升高，p21表達(dá)水平降低，HT29細(xì)胞活性以及遷移侵襲數(shù)量升高（

P

＜0.05）（表6，圖4）。

圖4 Cyclin D1、p21、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)

表6 抑制miR-148b-3p和LINC00963表達(dá)對(duì)HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作/±s

3 討論

目前，結(jié)直腸癌的發(fā)病率和死亡率均較高，復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移和耐藥已成為其臨床治療的主要問(wèn)題，特異性的靶向藥物可明顯提高腫瘤對(duì)藥物的反應(yīng)率，延長(zhǎng)病人的無(wú)病生存期和總生存期，改善病人生活質(zhì)量，延長(zhǎng)病人的生存時(shí)間。lncRNA影響腫瘤進(jìn)展，可作為其診斷、治療的靶點(diǎn)。LINC00963在黑色素瘤細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，干擾LINC00963通過(guò)miR-608/NACC1途徑可抑制黑色素瘤細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。LINC00963表達(dá)升高與非小細(xì)胞肺癌預(yù)后不良相關(guān)，可促進(jìn)體外非小細(xì)胞肺癌細(xì)胞遷移和侵襲。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞系HT29、SW480、SW1116中LINC00963表達(dá)水平升高，說(shuō)明LINC00963在結(jié)直腸癌細(xì)胞中高表達(dá)。且本研究還發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染si-LINC00963后，HT29細(xì)胞活性降低，遷移和侵襲數(shù)量降低；表明干擾LINC00963抑制結(jié)直腸癌的增殖、遷移和侵襲。此外，LINC00963還能抑制慢性腎功能衰竭大鼠腎間質(zhì)纖維化和氧化應(yīng)激?；|(zhì)金屬蛋白酶（MMP）中的MMP-2和MMP-9與腫瘤的浸潤(rùn)和轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，且在結(jié)直腸癌組織中呈高表達(dá)。細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）是細(xì)胞周期調(diào)控蛋白，其低表達(dá)會(huì)抑制細(xì)胞的生長(zhǎng)，有研究發(fā)現(xiàn)CyclinD1在結(jié)腸癌中過(guò)表達(dá)，也與結(jié)腸癌淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、腫瘤淋巴結(jié)遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移（TNM）分期及組織學(xué)類(lèi)型相關(guān)。而本研究結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染si-LINC00963后，結(jié)直腸癌中Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表達(dá)水平顯著降低，表明干擾LINC00963可抑制Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白的表達(dá)，進(jìn)一步證明干擾LINC00963可抑制結(jié)直腸癌的增殖、遷移和侵襲。

同樣miRNA作為一類(lèi)重要的基因表達(dá)調(diào)控因子，參與癌癥發(fā)生與發(fā)展。有研究報(bào)道m(xù)iR-148b-3p可通過(guò)直接靶向HOX轉(zhuǎn)錄物反義RNA（HOTAIR）抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為；miR-148b-3p通過(guò)抑制胞質(zhì)分裂作用因子6（Dock6）/Ras相關(guān)的C3肉毒素底物1（Rac1）/細(xì)胞分裂周期蛋白42（Cdc42）軸抑制胃癌轉(zhuǎn)移。miR-148b-3p還可抑制腎癌細(xì)胞及胃腸道間質(zhì)瘤882細(xì)胞的增殖和遷移。本研究結(jié)果顯示，結(jié)直腸癌細(xì)胞HT29、SW480、SW1116中miR-148b-3p的表達(dá)水平顯著降低，說(shuō)明miR-148b-3p在結(jié)腸癌中低表達(dá)。過(guò)表達(dá)miR-148b-3可降低HT29活性和遷移侵襲數(shù)量；說(shuō)明過(guò)表達(dá)miR-148b-3可抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。此外，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示miR-148b-3p受LINC00963的靶向調(diào)控，抑制miR-148b-3p表達(dá)能逆轉(zhuǎn)干擾LINC00963對(duì)HT29細(xì)胞的作用。提示，LINC00963影響HT29細(xì)胞增殖、遷移和侵襲機(jī)制或與miR-148b-3p相關(guān)。

綜上所述，干擾LINC00963可通過(guò)調(diào)控miR-148b-3p抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。