長鏈非編碼小核仁RNA宿主基因7調(diào)控微小RNA-331-3p表達(dá)影響甲狀腺癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的機(jī)制研究

常曉苗

近年來出現(xiàn)的靶向治療是甲狀腺癌新型治療手段，為難治性甲狀腺癌的治療提供了廣闊前景。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼RNA（lncRNA）、微RNA（miRNA）均可作為甲狀腺癌早期診斷和預(yù)后的生物標(biāo)志物以及靶向治療的新靶點(diǎn)。研究發(fā)現(xiàn)長鏈非編碼小核仁RNA宿主基因7（lncRNA SNHG7）在膀胱癌組織和細(xì)胞中過表達(dá)，下調(diào)lncRNA SNHG7可以抑制膀胱癌細(xì)胞的惡性生物學(xué)行為。沉默lncRNA SNHG7可抑制Fas凋亡抑制分子2（FAIM2）蛋白水平，抑制細(xì)胞增殖，遷移和侵襲，加速肺癌細(xì)胞凋亡。微小RNA-331-3p（miR-331-3p）促進(jìn)肝細(xì)胞癌的增殖和轉(zhuǎn)移。miR-331-3p在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞中下調(diào)表達(dá)可抑制增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡。但lncRNA SNHG7和miR-331-3p對甲狀腺癌的發(fā)生發(fā)展影響還尚未清楚。本研究旨在研究lncRNA SNHG7和miR-331-3p對甲狀腺癌發(fā)生發(fā)展的影響及SNHG7是否調(diào)控miR-331-3p。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1和人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1購自中國科學(xué)院上海細(xì)胞庫；RPMI-1640培養(yǎng)基（美國Gibico公司）；熒光定量PCR試劑盒（日本TaKaRa）；Transwell小室、基質(zhì)膠（美國BD公司）；四甲基偶氮唑鹽比色法（MTT）試劑盒、放射免疫沉淀分析（RIPA）蛋白裂解液盒（上海碧云天）。本研究起止時間為2018年1月至2019年2月。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)與分組人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1和人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1用RPMI-1640培養(yǎng)基于37℃、5%二氧化碳條件下培養(yǎng)；取對數(shù)生長期細(xì)胞TPC-1，將其分為si-NC組（轉(zhuǎn)染SNHG7干擾表達(dá)載體陰性對照）、si-SNHG7組（轉(zhuǎn)染SNHG7干擾表達(dá)載體）、pcDNA組（轉(zhuǎn)染SNHG7過表達(dá)載體陰性對照）、pcDNA-SNHG7組（轉(zhuǎn)染SNHG7過表達(dá)載體）、si-SNHG7+anti-miR-NC（共轉(zhuǎn)染SNHG7干擾表達(dá)載體和miR-331-3p抑制劑陰性對照）、si-SNHG7+anti-miR-331-3p組（共轉(zhuǎn)染SNHG7干擾表達(dá)載體和miR-331-3p抑制劑）；正常培養(yǎng)的細(xì)胞作為空白對照組。

1.2.2 qRT-PCR檢測miR-331-3p和SNHG7 mRNA表達(dá)水平提取Nthy-ori 3-1和人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1以及各組TPC-1細(xì)胞的總RNA，合成cDNA后進(jìn)行PCR擴(kuò)增，相對表達(dá)量采用2法計算。miR-331-3p正 向 引 物：5′-AGGCCCCTGGGCCTATC-3′，反向引物：5′-CAGTGCAGGGTCCGAGGT-3′。U6正 向 引 物：5′-CGCTTCGGCACATATAC-3′，反 向 引 物：5′-TTCACGAATTTGCGTGTCAT-3′。SNHG7正向引物：5′-ACTAAGCCCTCCTGTGCAAC-3′，反 向 引 物：5′-TCCCAGATACCAGCGAAGGA-3′，產(chǎn)物長度為298 bp；GAPDH正向引物：5′-TGTTCGTCATGGGTGTGAAC-3′，反向引物：5′-ATGGCATGGACTGTGGTCAT-3′，產(chǎn)物長度為154 bp。

1.2.3 Western blot檢測蛋白的表達(dá)提取各組TPC-1細(xì)胞的總蛋白，進(jìn)行十二烷基硫酸鈉聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE），轉(zhuǎn)膜，5 %脫脂奶粉封閉1 h，加入細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、細(xì)胞周期蛋白依賴性激酶抑制劑1A（p21）、神經(jīng)鈣黏蛋白（Ncadherin）、上皮鈣黏蛋白（E-cadherin）一抗孵育過夜，加入山羊抗兔IgG-辣根過氧化物酶（HRP）二抗室溫孵育2 h，顯影，定影，測定各組蛋白條帶的吸光度，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）為內(nèi)參。

1.2.4 MTT檢測細(xì)胞增殖各組細(xì)胞培養(yǎng)24 h、48 h、72 h時，按試劑盒說明操作，檢測490 nm處吸光度（OD）值。

1.2.5 Transwell檢測細(xì)胞遷移和侵襲遷移實驗：將無血清重懸的100 μL細(xì)胞接種于Transwell上室，培養(yǎng)24 h，0.1%結(jié)晶紫染色后顯微鏡下隨機(jī)選取5個視野計數(shù)。侵襲實驗：將基質(zhì)膠平鋪于Transwell上室，其余同遷移操作。

1.2.6 熒光素酶報告基因檢測實驗檢測SNHG7對miR-331-3p的靶向調(diào)控構(gòu)建SNHG7野生型熒光素酶載體（WT-SNHG7）和SNHG7突變型熒光素酶表達(dá)載體（MUT-SNHG7），將WT-SNHG7和MUT-SN-HG7分 別與miR-NC和miR-331-3p共 轉(zhuǎn)染TPC-1細(xì)胞，按試劑盒說明書檢測。

2 結(jié)果

2.1 SNHG7與miR-331-3p在甲狀腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況

與人甲狀腺細(xì)胞Nthy-ori 3-1相比，人甲狀腺癌細(xì)胞K1、BCPAP、TPC-1中SNHG7的表達(dá)水平顯著升高；miR-331-3p的表達(dá)水平顯著下降，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＜0.05），見表1。

表1 SNHG7與miR-331-3p在甲狀腺癌細(xì)胞系中的表達(dá)情況/xˉ±s

2.2 干擾SNHG7表達(dá)對甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖的影響

與si-NC組相比，si-SNHG7組TPC-1細(xì)胞中Cyclin D1蛋白的表達(dá)水平顯著降低，p21的表達(dá)水平顯著升高，TPC-1細(xì)胞活性顯著降低（

P

＜0.05）；干擾SNHG7表達(dá)抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖，見圖1，表2。

表2 干擾SNHG7對TPC-1細(xì)胞增殖的影響/xˉ±s

圖1 Western blotting法檢測干擾SNHG7后CyclinD1、p21蛋白的表達(dá)

2.3 干擾SNHG7對TPC-1細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與si-NC組相比，si-SNHG7組E-caherin的表達(dá)水平升高，N-cadherin表達(dá)水平降低，且遷移和侵襲細(xì)胞數(shù)降低（

P

＜0.05）。干擾SBF2-AS1表達(dá)抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞遷移、侵襲。見表3。

表3 干擾SNHG7表達(dá)對TPC-1細(xì)胞遷移侵襲的影響/xˉ±s

2.4 SNHG7靶 向 調(diào) 控miR-331-3p

TargetScan預(yù)測到SNHG7與miR-331-3p存在結(jié)合位點(diǎn)。miR-331-3p與WT-SNHG7共轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞的熒光素酶活性顯著降低（

P

＜0.05）；而miR-331-3p與MUTSNHG7共轉(zhuǎn)染的TPC-1細(xì)胞的熒光素酶活性差異不 顯著，見 表4。pcDNA-SNHG7組細(xì) 胞TPC-1中miR-331-3p的表達(dá)水平顯著低于pcDNA組［（0.33±0.03）比（1.00±0.07），

P

＜0.05］；si-SNHG7組 細(xì) 胞TPC-1中miR-331-3p的表達(dá)水平顯著高于si-NC組［（2.37±0.20）比（1.01±0.11），

P

＜0.05］。提示SNHG7可靶向調(diào)控miR-331-3p的表達(dá)。

表4 TPC-1細(xì)胞的熒光素酶活性/±s

2.5 抑制miR-331-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾SNHG7表達(dá)對甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖的抑制作用

與si-NC組相比，si-SNHG7組Cyclin D1表達(dá)水平和TPC-1細(xì)胞活性降低，而p21表達(dá)水平升高；TPC-1細(xì)胞活性顯著降低（

P

＜0.05）；與si-SNHG7+anti-miR-NC組相比，si-SNHG7+anti-miR-331-3p組Cyclin D1表達(dá) 水平和TPC-1細(xì)胞活升高，而p21表達(dá)水平降低（

P

＜0.05）。提示抑制miR-331-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾SNHG7表達(dá)對甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖的抑制作用。見圖2，表5。

表5 抑制miR-331-3p表達(dá)逆轉(zhuǎn)干擾SNHG7表達(dá)對甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖的抑制作用/xˉ±s

圖2 Western blotting法檢測各組細(xì)胞增殖相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 抑制miR-331-3p和SNHG7表達(dá)對TPC-1細(xì)胞遷移侵襲的作用

與si-NC組相比，si-SNHG7組E-caherin表達(dá)水平升高，N-cadherin表達(dá)水平和TPC-1細(xì)胞遷移侵襲數(shù)降低（

P

＜0.05）；與si-SNHG7+anti-miRNC組相比，si-SNHG7+anti-miR-331-3p組E-caherin表達(dá)水平降低，而N-cadherin表達(dá)水平和TPC-1細(xì)胞遷移和侵襲數(shù)升高（

P

＜0.05），見圖3，表6。

表6 抑制miR-331-3p和SNHG7表達(dá)對TPC-1細(xì)胞遷移侵襲的作用/xˉ±s

圖3 Western blotting法檢測各組細(xì)胞遷移及侵襲相關(guān)蛋白表達(dá)

3 討論

研究發(fā)現(xiàn)SNHG7在胰腺癌組織和細(xì)胞系中均高表達(dá)水平，SNHG7敲低抑制胰腺癌細(xì)胞的增殖，遷移和侵襲。SNHG7在胃癌組織和細(xì)胞中也上調(diào)表達(dá)，SNHG7表達(dá)受到干擾后，細(xì)胞凋亡率增加、G1/G0期細(xì)胞周期停滯，胃癌細(xì)胞的增殖受到抑制。SNHG7敲低通過miR-503抑制細(xì)胞周期蛋白D1表達(dá)，誘導(dǎo)細(xì)胞周期停滯在G0/G1期并抑制前列腺癌生長，揭示通過lncRNA/miRNA/mRNA軸可以影響腫瘤的生長。本研究中，甲狀腺癌細(xì)胞中SNHG7也同樣高表達(dá)，SNHG7靶向調(diào)控miR-331-3p，干擾SNHG7上調(diào)miR-331-3p，抑制CyclinD1蛋白的表達(dá)，抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞增殖。提示SNHG7可能通過miR-331-3p/CyclinD1影響甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的增殖。此外，干擾SNHG7還促進(jìn)p21的表達(dá)，而p21是一種新的抑癌基因，故干擾SNHG7通過促進(jìn)p21的表達(dá)抑制癌細(xì)胞的產(chǎn)生。

研究發(fā)現(xiàn)miR-331-3p可抑制多種癌細(xì)胞增殖。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，人甲狀腺癌細(xì)胞系中miR-331-3p下調(diào)表達(dá)，說明miR-331-3p在甲狀腺癌中也可能有抑癌作用。

上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）是指有極性的上皮細(xì)胞在特定的生理和病理情況下轉(zhuǎn)化成間質(zhì)細(xì)胞的現(xiàn)象，與腫瘤細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)。E-鈣黏蛋白（Ecadherin）和N-鈣黏蛋白（N-cadherin）均是EMT的生物標(biāo)志物，也轉(zhuǎn)移、侵襲相關(guān)。研究發(fā)現(xiàn)E-cadherin水平與甲狀腺癌的去分化程度、浸潤及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，下調(diào)E-cadherin的表達(dá)會促進(jìn)甲狀腺癌轉(zhuǎn)移。甲狀腺乳頭狀癌中的N-cadherin顯著上調(diào)，促進(jìn)了癌細(xì)胞的生長和侵襲。本研究結(jié)果顯示，干擾SNHG7表達(dá)可抑制N-cadherin表達(dá)，促進(jìn)E-caherin表達(dá)，且抑制TPC-1細(xì)胞的遷移和侵襲，提示SNHG7可能通過調(diào)控N-cadherin和E-caherin的表達(dá)影響甲狀腺癌細(xì)胞遷移和侵襲。而miR-331-3p抑制表達(dá)逆轉(zhuǎn)了干擾SNHG7表達(dá)對TPC-1細(xì)胞中CyclinD1、N-cadherin、p21、E-caherin蛋白的表達(dá)，逆轉(zhuǎn)了干擾SNHG7表達(dá)對TPC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲的作用；說明SNHG7可能通過調(diào)控miR-331-3p影響CyclinD1、N-cadherin、p21、E-caherin蛋白的表達(dá)進(jìn)而影響TPC-1細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。

綜上所述，干擾lncRNA SNHG7表達(dá)可通過上調(diào)miR-331-3p抑制甲狀腺癌TPC-1細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲。