長鏈非編碼SNHG15靶向miR-141對甲狀腺癌細(xì)胞侵襲及凋亡的影響研究

陳朝琴，薛治乾，李文霞

甲狀腺癌是頭頸部腫瘤及內(nèi)分泌系統(tǒng)中最常見的惡性腫瘤，女性發(fā)病率高于男性。甲狀腺癌的發(fā)病率在全球范圍內(nèi)呈現(xiàn)持續(xù)快速增長趨勢。近些年來，分子靶向治療腫瘤成為研究熱點(diǎn)。長鏈非編碼RNA（lncRNA）是一類轉(zhuǎn)錄本長度大于200 nt的非編碼RNA，在多種腫瘤中以原癌基因或抑癌基因形式存在，參與腫瘤發(fā)生和發(fā)展。lncRNA核仁小RNA宿主基因15（SNHG15）定位于7p13染色體上，與乳腺癌、胰腺癌、骨肉瘤等多種腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。研究顯示，lncRNA SNHG15在甲狀腺癌細(xì)胞中表達(dá)升高，抑制lncRNA SNHG15表達(dá)可降低細(xì)胞增殖能力，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但其對甲狀腺癌細(xì)胞侵襲、凋亡的分子機(jī)制尚未明確。生物信息學(xué)預(yù)測顯示，miR-141是lncRNA SNHG15的靶基因。本研究起止時(shí)間為2018年10月至2019年5月，以甲狀腺癌FRO細(xì)胞為研究對象，旨在探討lncRNA SNHG15是否通過調(diào)控miR-141表達(dá)影響甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲和凋亡。

1 材料與方法

1.1 試劑和儀器

人甲狀腺癌FRO細(xì)胞購自美國ATCC。DMEM培養(yǎng)基、FBS均購自美國Gibco公司；實(shí)時(shí)熒光定量PCR試劑盒及反轉(zhuǎn)錄試劑盒均購自日本TaKaRa公司；SNHG15小干擾RNA（si-SNHG15）、miR-141抑制劑inhibitor（anti-miR-141）及miR-141模擬物（mimics）均由上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司合成；Transwell小室購自美國corning公司；細(xì)胞凋亡試劑盒及流式細(xì)胞儀均購自美國BD公司；鼠抗人上皮鈣黏素（E-cadherin）單抗、鼠抗人B細(xì)胞淋巴瘤/白血病-2（Bcl-2）單抗、鼠抗人Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）單抗及HRP標(biāo)記的二抗均購自美國CST；二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測定試劑盒購自上海碧云天公司。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

FRO細(xì)胞在含10% FBS的DMEM培養(yǎng)基中，于5%體積分?jǐn)?shù)二氧化碳、飽和濕度及37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)、傳代。選擇生長至對數(shù)期的細(xì)胞進(jìn)行試驗(yàn)研究。

1.3 轉(zhuǎn)染

待FRO細(xì)胞生長至對數(shù)期后，以3×10個(gè)/孔接種于6孔板中，37℃培養(yǎng)箱過夜，使轉(zhuǎn)染時(shí)細(xì)胞達(dá)到70%～80%的生長融合度。參照Lipofectamine 2000試劑盒（美國Invitrogen）說明，將SNHG15小干擾RNA（siRNA）、siRNA陰性對照（siRNA control）、miR-141抑制劑（miR-141 inhibitor）或抑制劑陰性對照（inhibitor control）轉(zhuǎn)染至甲狀腺癌FRO細(xì)胞，細(xì)胞隨機(jī)分組空白對照（si-control）組、轉(zhuǎn)染陰性對照（si-NC）組、轉(zhuǎn)染SNHG15 siRNA（si-SNHG15）組、轉(zhuǎn)染SNHG15 siRNA和inhibitor control（si-SNHG15+anti-control）組和轉(zhuǎn)染SNHG15 siRNA和miR-141 inhibitor（si-SNHG15+anti-miR-141）組。轉(zhuǎn)染48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)研究。

1.4 qRT-PCR實(shí)驗(yàn)

提取細(xì)胞總RNA，并逆轉(zhuǎn)錄合成為cDNA。以cDNA為模板，參照PCR試劑盒設(shè)置反應(yīng)條件，反應(yīng)體系為20 μL，采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀 進(jìn) 行擴(kuò)增。SNHG15：正向引物5′-CAACCATAGCGGTGCAAC TGTGC-3′，反 向 引 物3′-GGCTGAACCAAGTTGCAAGTC ATG-5′。SNHG15內(nèi)參GAPDH：正向引物5′-CAGTGCCAGCCTCGTCTAT-3′，反向引物：3′-AGGGGCCATCCACAGTCTTC-5′。miR-141：正向引物5′-GGGCATCTTCCAGTACAGT-3′，反向引物3′-CAGTGCGTGTCG TGGAGT-5′。miR-141內(nèi)參U6：正向引物5′-CTCGCTTCGGCAGCACATATACT-3′，反向引物3′-ACGCTTCACGAATTTGCGTGTC-5′。

以檢測所得到的Ct均值，采用2方法計(jì)算SNHG15和miR-141的相對表達(dá)量。每組設(shè)置6個(gè)復(fù)孔，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.5 細(xì)胞侵襲能力檢測

采用Transwell實(shí)驗(yàn)檢測甲狀腺癌細(xì)胞的侵襲能力。Transwell小室上室接種5×10個(gè)含無血清培養(yǎng)基的細(xì)胞，下室裝含有10% FBS的培養(yǎng)基。37℃條件下孵育細(xì)胞48 h，甲醇固定，結(jié)晶紫染色，棉簽輕輕擦除小室內(nèi)基底膜的細(xì)胞。顯微鏡下每膜隨機(jī)選擇5個(gè)視野，計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。取均值，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

1.6 細(xì)胞凋亡檢測

收集轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞，制備成單細(xì)胞懸液，并將細(xì)胞濃度調(diào)整為5×10個(gè)/毫升。取1 mL細(xì)胞，離心，棄掉上清，預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞，離心，棄掉上清，加200 μL的結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，然后再加入Annexin V-FITC和PI各5 μL，輕柔混勻，室溫條件下避光反應(yīng)15 min，1 h內(nèi)，通過流式細(xì)胞儀檢測。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次，取均值，計(jì)算細(xì)胞的凋亡率。

1.7 熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)

Diana Tools、Starbase和TargetScan靶基因軟件顯示SNHG15與miR-141有可結(jié)合的位點(diǎn)，構(gòu)建野生型（WT）及突變型（MUT）SNHG15載體，與miR-141 mimics共轉(zhuǎn)染進(jìn)FRO細(xì)胞。按照熒光素酶活性檢測試劑盒說明檢測FRO細(xì)胞熒光素酶活性。相對熒光素酶活性=螢火蟲熒光素酶活性值/海參熒光素酶活性值。

1.8 蛋白表達(dá)檢測

細(xì)胞中加入適量蛋白裂解液提取總蛋白，BCA法測定蛋白濃度。蛋白于100℃變性5 min，每孔道上樣30 μg變性蛋白，12% SDS-PAGE分離蛋白，常規(guī)濕法轉(zhuǎn)膜，然后加5%脫脂奶粉封閉膜2 h，洗膜，加E-cadherin、Bcl-2、Bax及內(nèi)參GAPDH一抗（1∶500），4℃孵育過夜，洗膜，加二抗（HRP標(biāo)記的羊抗鼠），37℃搖床震蕩封閉1 h，加入ECL液，凝膠成像系統(tǒng)曝光，Quantity One軟件對蛋白印跡條帶定量。以檢測的目的蛋白與GAPDH蛋白灰度值比值為各蛋白的相對表達(dá)量。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2 結(jié)果

2.1 抑制SNHG15表達(dá)對FRO細(xì)胞侵襲能力的影響

qRT-PCR結(jié)果顯示，si-SNHG15轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞48 h，SNHG15 mRNA表達(dá)明顯低于si-control組（

P

＜0.05），而si-NC組SNHG15 mRNA表達(dá)與si-control組差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。Transwell小室檢測細(xì)胞侵襲結(jié)果顯示，與si-control組比較，si-SNHG15組細(xì)胞侵襲能力明顯降低（

P

＜0.05）。見表1。

表1 抑制SNHG15表達(dá)后FRO細(xì)胞SNHG15 mRNA表達(dá)及侵襲細(xì)胞數(shù)/±s

2.2 抑制SNHG15表達(dá)對FRO細(xì)胞凋亡的影響

Annexin V-FITC/PI雙染后流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，與si-control組（4.31±0.42）%和si-NC組（4.68±0.53）%比較，si-SNHG15組FRO細(xì)胞凋亡率（33.11±1.69）%明顯升高（

P

＜0.05）。見圖1。

圖1 抑制SNHG15表達(dá)后FRO細(xì)胞凋亡圖

2.3 靶向關(guān)系驗(yàn)證

經(jīng)生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，SNHG15和miR-141存在可結(jié)合的位點(diǎn)（圖2）。將SNHG15野生型（SNHG15-WT）及SNHG15突變型（SNHG15-MUT）分別與miR-141mimics共轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞，雙熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)顯示，SNHG15-WT與miR-141mimics共轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞后，熒光素酶活性明顯降低（

P

＜0.05），而SNHG15-MUT與miR-141mimics共轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞后，熒光素酶活性無明顯變化（

P＞

0.05）（表2），說明SNHG15與miR-141存在靶向關(guān)系。qRTPCR結(jié)果顯示，與si-control組（1.000）相比，si-SNHG15組細(xì)胞中miR-141 mRNA表達(dá)（3.012±0.187）明顯升高（

P

＜0.05），而 與si-SNHG15+anti-control組（3.045±0.172）相比，si-SNHG15+anti-miR-141組相比中miR-141 mRNA表達(dá)（1.413±0.067）明顯降低（

P

＜0.05）。說明SNHG15靶向負(fù)調(diào)控miR-141表達(dá)。

圖2 生物信息學(xué)預(yù)測SNHG15和miR-141的結(jié)合位點(diǎn)

表2 熒光素酶活性檢測結(jié)果/±s

2.4 抑制miR-141表達(dá)可減弱SNHG15對FRO細(xì)胞侵襲和凋亡的影響

如表3所示，si-SNHG15轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞后，與si-control組比較，si-SNHG15組細(xì)胞侵襲能力明顯降低，凋亡率升高（

P

＜0.05），而將si-SNHG15與anti-miR-141共同 轉(zhuǎn)染FRO細(xì) 胞 后，與si-SNHG15+anti-control組比較，細(xì)胞侵襲能力明顯升高，凋亡率降低（

P

＜0.05）。

表3 SNHG15靶向miR-141對FRO細(xì)胞侵襲和凋亡影響/±s

2.5 抑制miR-141表達(dá)可減弱SNHG15對FRO細(xì)胞E-cadherin、Bcl-2和Bax表達(dá)的影響

Western blotting檢測抑制SNHG15或共同抑制SNHG15和miR-141表達(dá)后FRO細(xì)胞侵襲相關(guān)的E-cadherin及與凋亡相關(guān)的Bcl-2和Bax表達(dá)，結(jié)果如圖3和表4所示，與si-control組比較，si-SNHG15組E-cadherin和Bax表達(dá)明顯升高，Bcl-2表達(dá)明顯降低（

P

＜0.05），將si-SNHG15與anti-miR-141共同轉(zhuǎn)染FRO細(xì)胞后，與si-SNHG15+anti-control組比較，E-cadherin和Bax表達(dá)明顯降低，Bcl-2表達(dá)明顯升高（

P

＜0.05）。

表4 SNHG15靶向miR-141對FRO細(xì)胞E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響/±s

圖3 FRO細(xì)胞E-cadherin、Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)條帶

3 討論

作為一種新近發(fā)現(xiàn)的非編碼RNA類，lncRNA在人類疾病診斷及腫瘤治療中應(yīng)用廣泛。lncRNA可通過多種分子機(jī)制及途徑對基因表達(dá)進(jìn)行調(diào)解，進(jìn)而影響多種生物學(xué)功能，其表達(dá)及調(diào)控異常與多種惡性腫瘤發(fā)生及發(fā)展密切相關(guān)。目前大量研究表明lncRNA可作為腫瘤診療的一種生物標(biāo)志物。因此，研究lncRNA在甲狀腺癌中的作用對于其治療尤為重要。有研究顯示，肝癌組織中l(wèi)ncRNA SNHG15表達(dá)高于臨近非腫瘤組織，其表達(dá)與組織學(xué)分級、TNM分期及靜脈侵襲有關(guān)；lncRNA SNHG15可通過調(diào)節(jié)miR-153影響膠質(zhì)瘤微血管內(nèi)皮細(xì)胞的生長；上調(diào)lncRNA SNHG15表達(dá)可通過調(diào)控基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）/基質(zhì)金屬蛋白酶9（MMP9）促進(jìn)胃癌細(xì)胞侵襲和遷移。但lncRNA SNHG15對甲狀腺癌的影響還未知。本研究將SNHG15特異性siRNA轉(zhuǎn)染甲狀腺癌FRO細(xì)胞，SNHG15表達(dá)明顯降低，細(xì)胞侵襲能力降低，凋亡率升高，提示抑制SNHG15表達(dá)可明顯降低甲狀腺癌細(xì)胞生長。

微小RNA（microRNA或miRNA）是一類非編碼小分子RNA，長度約為18～22 nt，可在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)基因表達(dá)，miR-141是微小RNA家族中的一員，與結(jié)直腸癌、乳腺癌等多種腫瘤細(xì)胞生長有關(guān)。研究顯示，甲狀腺癌中miR-141表達(dá)降低，miR-141可通過靶向胰島素受體底物2抑制甲狀腺癌細(xì)胞生長和轉(zhuǎn)移。生物信息學(xué)顯示SNHG15與miR-141有可結(jié)合位點(diǎn)，本研究通過熒光素酶報(bào)告實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步證實(shí)SNHG15靶向負(fù)調(diào)控miR-141表達(dá)。細(xì)胞侵襲及凋亡實(shí)驗(yàn)表明，抑制SNHG15與miR-141表達(dá)可減弱抑制SNHG15對甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和凋亡的影響，說明SNHG15可調(diào)控miR-141影響甲狀腺癌細(xì)胞侵襲和凋亡。

腫瘤侵襲遷移是一個(gè)復(fù)雜的過程，EMT是影響腫瘤侵襲轉(zhuǎn)移的一個(gè)關(guān)鍵步驟，而E-cadherin的減少或丟失是EMT形成的一個(gè)最重要標(biāo)志。有研究顯示，BCORL1可通過下調(diào)E-cadherin促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移；Dickkopf-1（DKK-1）可通過抑制β-catenin/E-cadherin促進(jìn)甲狀腺癌細(xì)胞存活和遷移。本研究結(jié)果顯示，抑制SNHG15表達(dá)可上調(diào)E-cadherin表達(dá)，而同時(shí)抑制SNHG15和miR-141表達(dá)可降低E-cadherin表達(dá)，提示SNHG15調(diào)控miR-141對甲狀腺癌侵襲影響與調(diào)節(jié)E-cadherin表達(dá)有關(guān)。誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡是腫瘤治療的主要機(jī)制。Bcl-2和Bax均為Bcl-2家族成員，發(fā)揮抑凋亡和促凋亡作用，Bcl-2/Bax比率是啟動細(xì)胞凋亡的“分子開關(guān)”，是目前研究較多的與腫瘤凋亡相關(guān)的兩個(gè)基因。多項(xiàng)研究表明，對Bcl-2和Bax表達(dá)調(diào)節(jié)可影響腫瘤細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示，抑制SNHG15表達(dá)可上調(diào)Bax表達(dá)，下調(diào)Bcl-2表達(dá)，而同時(shí)抑制SNHG15和miR-141表達(dá)可下調(diào)Bax表達(dá)，上調(diào)Bcl-2表達(dá)，提示SNHG15調(diào)控miR-141對甲狀腺癌細(xì)胞凋亡影響與調(diào)節(jié)Bcl-2和Bax表達(dá)有關(guān)。

綜上所述，SNHG15可靶向調(diào)節(jié)miR-141表達(dá)，降低甲狀腺癌細(xì)胞侵襲能力，誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，機(jī)制與調(diào)節(jié)E-cadherin、Bcl-2和Bax表達(dá)有關(guān)。本研究可能為甲狀腺癌的診療提供理論依據(jù)，但仍需更深入的探究。