內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白1過表達對缺氧/復(fù)氧誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡的影響

蘇長英，孟艷紅，吳美齡

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療心肌梗死雖然取得一定成效，但可造成心肌缺血再灌注損傷，并發(fā)心律失常、心力衰竭等嚴重后果。研究發(fā)現(xiàn)，心肌細胞凋亡和氧化損傷等與缺血再灌注損傷密切相關(guān)。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激是體內(nèi)氧化應(yīng)激最重要的形式之一，可參與各種糖尿病心肌病、阿爾茲海默病等疾病及嚴重并發(fā)癥的發(fā)生。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白1（SERP1）是一種可緩解內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激損害的未折疊蛋白應(yīng)答反應(yīng)的重要伴侶蛋白，可在內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激導(dǎo)致的組織細胞凋亡及自噬中發(fā)揮重要緩解作用。然而目前關(guān)于SERP1對心肌細胞的影響尚鮮有研究，因此，2018年1—12月進行本研究，擬通過過表達SERP1基因后探究其與缺氧/復(fù)氧（Hypoxia reoxygenation anoxia/reoxygenation，H/R）誘導(dǎo)的大鼠H9c2心肌細胞凋亡的緩解作用?，F(xiàn)報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料

大鼠H9c2心肌細胞系來自中國科學(xué)院上海細胞庫；本研究符合一般動物實驗倫理學(xué)原則。無糖DMEM培養(yǎng)基（貨號11966-025）、胎牛血清（FBS，貨號10099141）均購自美國Gibco；pCMV6-網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白1（pCMV6-SERP1）過表達質(zhì)粒、pCMV6空載質(zhì)粒（美國Origene公司）、Trizol試劑（貨號R0016）、蛋白抽提試劑盒（批次P0028）、二喹啉甲酸（BCA）蛋白定量試劑盒（批次P0010S）、甲基噻唑藍（MTT）試劑盒（批次C0009）、Annexin V-FITC/PI細胞凋亡檢測試劑盒（批次C1062S）購自上海碧云天有限公司；PrimeScript?RT reagent Kit（Perfect Real Time）（編號RR037A）、TB GreenPremix Ex Taq?Ⅱ（Tli RNaseH Plus）（編號RR820A）購自TaKaRa生物公司；引物由上海吉瑪生物科技有限公司合成；半胱氨酸蛋白酶-3（caspase-3）活性檢測試劑盒（貨號CASP3F）購自美國Sigma；Lipofectamine2000轉(zhuǎn)染試劑盒（貨號11668-0.75mL）、鼠源一抗三磷酸甘油醛脫氫酶（GAPDH）（貨號AM4300）、B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）（貨號13-8800）、Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）（貨號MA5-13994），一抗兔源內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)蛋白1（SERP1）（貨號PA5-21385）、二抗羊抗鼠免疫球蛋白G（IgG）（貨號A-11001）、羊抗兔IgG（貨號A-11008）均購自美國Invitrogen；紫外分光光度計（美國Thermo公司）、FC酶標儀、Forma Steri-Cycle i160 5%二氧化碳培養(yǎng)箱購自美國Thermo Fisher；FACS CantoⅡ流式細胞儀購自美國BD；IX73倒置顯微鏡購自日本Olympus等。

1.2 方法

1.2.1 H9c2心肌細胞培養(yǎng)及H/R細胞模型建立采用含有10%FBS、1%青鏈霉素DMEM細胞培養(yǎng)液于37℃5%二氧化碳培養(yǎng)箱培養(yǎng)正常培養(yǎng)H9c2心肌細胞，設(shè)為正常對照組（NC組）。細胞傳代時用0.05%胰蛋白酶消化。待細胞匯合度約80%，棄去原培養(yǎng)基，加入無血清DMEM培養(yǎng)基，于37℃、5%二氧化碳、95%氮氣的缺氧培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，之后于37℃5%二氧化碳空氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h，即為H/R H9c2心肌細胞模型，設(shè)為H/R組。

1.2.2 細胞轉(zhuǎn)染將H/R H9c2心肌細胞傳代于6孔細胞培養(yǎng)板中，每孔約1×10個細胞，待細胞匯合度約50%～60%進行細胞轉(zhuǎn)染。①Lipofectamine2000+Opti-MEM培養(yǎng)基混合均勻后室溫孵育5 min；②Lipofectamine2000+pCMV6/pCMV6-SERP1分別混勻后室溫孵育5 min；③將①分別與②中試劑等量混勻后室溫孵育20 min后，逐滴加入H/R H9c2心肌細胞中，分別設(shè)為H/R+pCMV6組和H/R+pCMV6-SERP1組，分組6個重復(fù)，以保證結(jié)果的可靠性。

1.2.3 H9c2心肌細胞SERP1mRNA水平檢測采用Trizol提取各組H9c2心肌細胞總RNA，用紫外分光光度計檢測總RNA濃度及純度。反轉(zhuǎn)錄得到cDNA，置于-20℃保存?zhèn)溆谩２捎茫╮eal-time quantitative PCR，RT-qPCR）檢測SERP1mRNA表達水平。RT-qPCR采用20 μL反應(yīng)體系：TB Green Premix Ex TaqⅡ（Tli RNaseH Plus）（2×）10 μL，ROX Reference Dye or DyeⅡ（50×）0.4 μL，cDNA（50 ng/μL）2 μL，上下游引物（10 μmol/L）各0.8 μL，雙蒸水6.0 μL。反應(yīng)采用兩步法，條件設(shè)置為：95℃，30 s；95℃，5 s；60℃，34 s，40個循環(huán)；添加溶解曲線。SERP1 mRNA：正向引物（5′→3′）CTGAAGAGAACGAGCGGCTCAAG；反向引物（5′→3′）GACAGGAGGTGATGCCAACAGTTC。內(nèi)參GAPDH：正向引物（5′→3′）GTCGATGGCTAGTCGTAGCATCGAT；反向 引 物（5′→3′）TGCTAGCTGGCATGCCCGATCGATC。采 用2法 各 組H9c2心 肌 細 胞 中SERP1mRNA的相對表達水平進行定量分析。

1.2.4 H9c2心肌細胞SERP1、Bax、Bcl-2蛋白水平檢測提取各組H9c2心肌細胞總蛋白，嚴格按照蛋白提取試劑盒操作說明書進行，蛋白濃度采用BCA蛋白濃度測定試劑盒進行測定，提取的蛋白置于-80℃保存?zhèn)溆?。加?/5體積6×SDS上樣緩沖液，95℃、5 min，冷卻離心后置于-20℃保存?zhèn)溆?。?0 μg蛋白樣品，以GAPDH為內(nèi)參，采用6%SDS-PAGE膠進行電泳。濕轉(zhuǎn)法將膠上蛋白轉(zhuǎn)移至NC膜，5%脫脂奶粉室溫封閉2 h，加入適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋，加一抗（Bcl-2抗體1∶500；Bax抗體1∶500；SERP1抗體1∶500；GAPDH抗體1∶500）4℃孵育過夜，TBST緩沖液洗膜3次，每次20 min，用適量含2%脫脂奶粉的PBS稀釋辣根過氧化物酶標記的二抗IgG（1∶5 000）室溫孵育2 h，按上述方法洗膜，顯色，曝片，觀察并分析結(jié)果。

1.2.5 H9c2心肌細胞存活率檢測將NC組、H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組細胞接種于96孔板，每孔約0.5×10個/孔，每孔添加培養(yǎng)液200 μL。培養(yǎng)結(jié)束后用MTT試劑盒檢測各孔細胞增殖情況，具體操作嚴格按照說明書進行。細胞存活率=（OD/OD）×100%。

1.2.6 H9c2心肌細胞凋亡情況檢測取各組生長至對數(shù)期的H9c2心肌細胞以2×10個/孔接種于6孔細胞培養(yǎng)板中，待細胞融合至80%。培養(yǎng)48 h后每孔500 μL結(jié)合緩沖液重懸細胞，加入5 μL Annexin V-FITC混勻后，加5 μL PI，避光輕輕振蕩混勻，室溫放置15 min。同時設(shè)置陰性對照（無Annexin VFITC和PI），放入流式細胞儀檢測H9c2心肌細胞凋亡情況，并計算細胞凋亡率。

2 結(jié)果

2.1 各組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA及蛋白水平比較

與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組H9c2心肌細胞SERP1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞SERP1 mRNA及蛋白表達水平顯著增加（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組 比 較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA及蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05）。詳見表1，圖1。

圖1 免疫印跡法檢測H9c2心肌細胞中SERP1蛋白表達

表1 各組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA水平比較/±s

2.2 各組H9c2心肌細胞存活率比較

與NC組［（100.00±00.00）%］比較，H/R組［（49.86±5.14）%］、H/R+pCMV6組［（48.75±5.23）%］、H/R+pCMV6-SERP1組［（89.72±8.61）%］H9c2心肌細胞存活率顯著降低（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中存活率顯著升高（

P

＜0.05）。

2.3 各組H9c2心肌細胞凋亡率比較

與NC組［（4.45±0.62）%］比較，H/R組［（35.84±4.13）%］、H/R+pCMV6組［（33.66±4.07）%］、H/R+pCMV6-SERP1組［（10.96±1.74）%］H9c2心肌細胞凋亡率顯著增加（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞凋亡率顯著降低（

P

＜0.05）。

2.4 各組H9c2心肌細胞中凋亡相關(guān)蛋白檢測

與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞Bcl-2相關(guān)X蛋白（Bax）、半胱氨酸蛋白酶-3（Caspase-3）蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平降低（

P

＜0.05）。詳見表2，圖2。

圖2 免疫印跡法檢測H9c2心肌細胞中Caspase-3、Bax、Bcl-2蛋白表達

表2 各組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA水平比較/±s

3 討論

本研究發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組H9c2心肌細胞SERP1 mRNA及蛋白表達水平顯著降低，與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中SERP1 mRNA及蛋白水平升高，且比NC組高2倍多，提示H/R可抑制SERP1表達，轉(zhuǎn)染pCMV6-SERP1質(zhì)粒后，SERP1過表達成功，可用于下游試驗。

H/R誘導(dǎo)的心肌損傷是一種復(fù)雜的病理生理過程，多伴隨心肌細胞壞死、凋亡及自噬，心肌細胞生存率降低和凋亡率增加是心肌損傷、心肌梗死病理性心肌重塑、心力衰竭等疾病發(fā)生的重要機制。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是多種重要細胞蛋白合成折疊和裝配的中心場所，高糖或缺氧等狀態(tài)會引發(fā)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（ESR），持續(xù)ESR會導(dǎo)致內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能受損，促進細胞凋亡。馮麗帥等研究報道，SERP1過表達可抑制過氧化氫引起的內(nèi)皮細胞凋亡，促進氧化應(yīng)激狀態(tài)下血管內(nèi)皮細胞增殖修復(fù)。劉岳等研究報道，SERP1過表達可以抑制lncRNA CDKN2B-AS1表達，并進一步導(dǎo)致酪氨酸蛋白激酶2（JAK2）和信號轉(zhuǎn)異子與激活子3（STAT3）磷酸化水平增強，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激標志蛋白葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（GRP78）與C/EBP環(huán)磷酸腺苷反應(yīng)元件結(jié)合轉(zhuǎn)錄因子同源蛋白（CHOP）表達降低，減少糖氧剝奪導(dǎo)致的心肌細胞凋亡。Shang等研究報道，SERP1與心肌缺血再灌注損傷密切相關(guān)，SERP1過表達可通過激活JAK2/STAT3通路減少H/R誘導(dǎo)的H9c2心肌細胞凋亡。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞存活率降低、凋亡率增加，但與H/R組、H/R+pCMV6組比較，SERP1過表達組H9c2心肌細胞中存活率升高、凋亡率又降低，提示H/R處理可能促進H9c2心肌細胞凋亡，SERP1過表達后可促進H9c2心肌細胞增殖修復(fù)，抑制其凋亡，與文獻報道一致。

研究發(fā)現(xiàn)，紅細胞沉降率（ESR）與肌醇需求酶a/c-Jun氨基末端激酶（IREa/JNK）通路、肌醇需求酶1a/c-Jun氨基末端激酶（IRE1a/JNK）通路和半胱氨酸蛋白酶-12（caspase-12）級聯(lián)反應(yīng)等多種信號通路有關(guān)，其中肌醇需求酶1a（IRE1a）通過腫瘤壞死因子受體相關(guān)因子2（TRAF2）調(diào)節(jié)p38絲裂原活化蛋白激酶（MAPK）和細胞外信號調(diào)節(jié)激酶通路（ERK），進而介導(dǎo)c-Jun氨基末端激酶（JNK）磷酸化促進細胞凋亡。ESR反應(yīng)中促凋亡信號caspase-12和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)CHOP蛋白表達量顯著增加，被激活的caspase-12從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)進入細胞液中直接或間接激活caspase-3引起細胞凋亡，pERK持續(xù)激活還可促進凋亡蛋白轉(zhuǎn)錄激活因子-3（ATF-3）、C/EBP同源蛋白（CHOP），抑制B淋巴細胞瘤-2（Bcl-2）蛋白表達，發(fā)揮促凋亡作用。Bcl-2、Bax是重要的細胞凋亡相關(guān)基因，二者同屬于Bcl-2家族，Bax卻是一種促凋亡蛋白與Bcl-2功能相反，另Bcl-2又可通過抑制Caspase-3抑制細胞凋亡。郭紅雨等研究報道，缺氧/復(fù)氧H9c2心肌細胞中脯氨酰異構(gòu)酶1沉默后細胞凋亡率降低，其中Bcl-2蛋白表達升高，Bax蛋白表達降低，Bcl-2/Bax升高，Caspase-3蛋白水平降低。任安立等研究報道，沉默程序化細胞死亡因子5可通過促進Bax、抑制Bcl-2蛋白表達保護H9c2心肌細胞因H/R損傷誘導(dǎo)的凋亡和自噬。本研究結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與NC組比較，H/R組、H/R+pCMV6組、H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心 肌 細 胞Bax、Caspase-3蛋白表達水平顯著升高，Bcl-2蛋白水平顯著降低，與H/R組、H/R+pCMV6組比較，H/R+pCMV6-SERP1組H9c2心肌細胞中Bcl-2蛋白水平顯著升高，Bax、Caspase-3蛋白表達水平降低，提示SERP1過表達可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白，下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白發(fā)揮抑制H9c2心肌細胞凋亡作用，但具體通路還有待進一步研究。

綜上所述，SERP1過表達可能通過上調(diào)Bcl-2蛋白，下調(diào)Bax、Caspase-3蛋白促進H9c2心肌細胞增殖修復(fù)，抑制其凋亡，發(fā)揮心肌保護作用，但應(yīng)具體通路及調(diào)控機制還有待進一步深入探究。