慢病毒介導(dǎo)的細胞分裂周期相關(guān)蛋白2基因沉默對乳腺癌細胞增殖和凋亡的影響

矯璐宇，秦春新，楊小青，于浩，王子良

乳腺癌是女性疾病中常見惡性腫瘤之一，隨著 現(xiàn)代生活節(jié)奏的加快及生活壓力的增大導(dǎo)致乳腺癌呈年輕化發(fā)展趨勢。研究表明乳腺癌發(fā)病機制與細胞周期異常、細胞惡性增殖等密切相關(guān)。細胞分裂周期相關(guān)蛋白2（CDCA2）可調(diào)控細胞周期進程，研究報道指出CDCA2在胰腺導(dǎo)管腺癌組織中表達水平明顯升高，敲低CDCA2表達可抑制胰腺癌細胞增殖能力。CDCA2在肺腺癌組織中高表達，其表達量升高可作為肺腺癌患者預(yù)后不良的獨立預(yù)測因子，進一步研究發(fā)現(xiàn)抑制CDCA2表達可通過下調(diào)細胞周期蛋白E1（CCNE1）而抑制肺腺癌細胞的增殖，而過表達CDCA2通過上調(diào)CCNE1促進肺腺癌細胞增殖。但CDCA2在乳腺癌致病機制中的研究尚未見相關(guān)報道。慢病毒siRNA干擾具有持續(xù)時間長、穩(wěn)定性高等優(yōu)點的敲除工具。本研究自2019年2—7月通過慢病毒介導(dǎo)的RNAi技術(shù)沉默乳腺癌細胞中CDCA2基因表達，觀察其對細胞增殖、凋亡及克隆能力的影響，探討其在乳腺癌治療及預(yù)防乳腺癌的潛在應(yīng)用價值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A購自上海昱都生物科技有限公司；乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549購自上?；鄯f生物科技有限公司；高度免疫缺陷雄性小鼠（20只），體質(zhì)量范圍為20～30 g，購自北京維通達生物技術(shù)有限公司，合格證號：SCXK（京）2017-0008。本研究中對于大鼠的處理符合動物倫理學(xué)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)。慢病毒LV3-shCDCA2、LV3-shNC均購自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；RPMI 1640培養(yǎng)基、胎牛血清均購自美國Gibco公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；細胞凋亡試劑盒購自美國Beckman公司；實時熒光定量逆轉(zhuǎn)錄聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）試劑盒均購自日本TaKaRa公司；鼠抗人細胞周期素D1（Cyclin D1）、CDK4、P21、B細胞淋巴瘤-2（Bcl-2）、Bcl-2相關(guān)X（Bax）多克隆抗體均購自美國Santa Cruz公司；兔抗人CDCA2單抗購自上海玉博生物科技有限公司（NeoMarkers品牌代理）；辣根過氧化物酶（HRP）標(biāo)記的山羊抗鼠、山羊抗兔IgG二抗均購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；MTT購自上海晶抗生物工程有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細胞培養(yǎng)及慢病毒感染乳腺癌MCF-7細胞人正常乳腺上皮細胞株MCF-10A、乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231、BT549細胞置于含有10%胎牛血清及1%青鏈霉素的RPMI 1640培養(yǎng)基內(nèi)，放入37℃、5%二氧化碳體積分?jǐn)?shù)、相對濕度95%的培養(yǎng)箱內(nèi)培養(yǎng)，細胞以1∶2比例進行傳代，待細胞穩(wěn)定傳代2～3代后，收集對數(shù)生長期乳腺癌MCF-7細胞，慢病毒LV3-shNC是不含目的基因的真核表達載體，慢病毒LV3-shCDCA2是含有CDCA2特異性siRNA表達載體。采用病毒介導(dǎo)法分別將LV3-shNC、LV3-shCDCA2轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞，應(yīng)用已確定篩選濃度的嘌呤霉素培養(yǎng)液進行抗性篩選，每隔2 d更換一次培養(yǎng)液，實時觀察細胞生長狀況，培養(yǎng)14 d后選取抗性克隆團進行后續(xù)實驗，進一步擴大培養(yǎng)后，抗性克隆形成7 d后，收集抗性克隆細胞，實驗將其分為對照組（空白組）、Lv-NC組（陰性對照組）、Lv-siRNA-CDCA2組（干擾組）。

1.2.2 qRT-PCR檢測細胞中CDCA2 mRNA表達水平采用Trizol法提取各組細胞總RNA，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄試劑盒合成cDNA，反應(yīng)條件為42℃30 min，95℃變性5 min，4℃退火5 min，cDNA進行qRT-PCR，反應(yīng)條件為95℃預(yù)變性5 min循環(huán)1次，95℃變性15 s，60℃退火60 s，72℃延伸30 s，共循環(huán)40次，實驗結(jié)果采用2法進行計算，即2，每組均設(shè)置3個復(fù)孔，實驗重復(fù)3次。

1.2.3 噻唑藍（MTT）檢測細胞增殖分別收集各組乳腺癌MCF-7細胞，以每孔5×10個細胞的密度將細胞接種于96孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，分別于24 h、48 h、72 h時每孔分別加入20 μL質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5 mg/mL的MTT，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)4 h，棄上清液，每孔各加入150 μL DMSO，充分溶解后，振蕩10 min，選擇490 nm波長在酶標(biāo)儀上檢測各孔光密度值（OD）。

1.2.4 平板克隆形成實驗收集對數(shù)生長期各組乳腺癌MCF-7細胞，使用0.25%胰酶消化細胞制備單細胞懸液，采用臺酚藍計數(shù)細胞，按照每孔300個細胞的密度將細胞接種于6孔板，每組細胞均設(shè)置3個復(fù)孔，按照“十”字方向晃動培養(yǎng)板促使細胞均勻分散，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)14 d，每天需將培養(yǎng)板置于顯微鏡下觀察細胞克隆形成情況，若培養(yǎng)板上出現(xiàn)肉眼可見克隆需終止培養(yǎng)，棄培養(yǎng)液，使用預(yù)冷PBS洗滌2次，加入甲醇3 mL固定15 min，棄固定液，加入吉姆薩染液2 mL染色30 min，沖洗染色液，干燥，置于顯微鏡下觀察克隆大小，將超過50個細胞團進行計數(shù)，克隆形成率（%）=（平均克隆數(shù)/每孔接種細胞數(shù)）×100%。

1.2.5 流式細胞術(shù)檢測細胞凋亡分別收集各組乳腺癌MCF-7細胞，以每孔5×10個細胞的密度將細胞接種于6孔板，放入37℃恒溫培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)72 h，參照Annexin V-FITC/PI上染細胞凋亡檢測試劑盒說明書進行操作，應(yīng)用流式細胞儀檢測細胞凋亡率。

1.2.6 蛋白免疫印跡法（Western blotting）檢測CDCA2、Cyclin D1、CDK4、P21、Bcl-2、Bax蛋白表達采用預(yù)冷RIPA裂解液處理各組細胞，應(yīng)用超聲破碎儀破碎細胞，4℃，12 000 r/min轉(zhuǎn)速10 min（離心半徑6cm），提取細胞總蛋白，采用BCA法定量蛋白，取30 μg蛋白樣品進行SDS-PAGE凝膠電泳反應(yīng)，轉(zhuǎn)膜，室溫條件下采用5%脫脂奶粉封閉2 h，分別加入稀釋后的一抗（稀釋比1∶1 000）4℃過夜，TBST清洗，室溫條件下加入稀釋后的二抗（稀釋比1∶5 000），ECL顯影，置于自動凝膠成像系統(tǒng)分析各蛋白條帶，蛋白相對表達量=目的蛋白條帶灰度值/內(nèi)參照條帶灰度值。

1.2.7 裸鼠移植瘤實驗LV3-shNC、LV3-shCDCA2轉(zhuǎn)染乳腺癌MCF-7細胞，轉(zhuǎn)染24 h后棄舊培養(yǎng)基，PBS洗滌，胰蛋白酶消化，制備單細胞懸液（1×10個/100 μL），4℃條件下，轉(zhuǎn)速1 000 r/min離心5 min，預(yù)冷PBS洗滌，1 mL注射器吸取100 μL細胞懸液注射入小鼠右側(cè)腋窩皮下，觀察并記錄裸鼠生長及移植瘤成長狀況，每周分別檢測腫瘤體積，第5周時使用脫頸法處死裸鼠，剝離腫瘤組織并進行稱重。

2 結(jié)果

2.1 乳腺癌細胞中CDCA2表達水平

qRT-PCR與Western blotting實驗結(jié)果顯示，與MCF-10A相比，乳腺癌細胞MCF-7、MDA-MB-231、BT549中CDCA2 mRNA及蛋白表達水平均顯著升高（

P

＜0.05），其中乳腺癌MCF-7細胞中CDCA2的表達水平升高最為顯著，因此選取乳腺癌MCF-7細胞進行后續(xù)研究，見圖1，表1。

圖1 乳腺癌細胞中CDCA2蛋白表達條帶

表1 乳腺癌細胞中CDCA2表達/±s

2.2 重組慢病毒siRNA CDCA2感染MCF-7細胞后CDCA2表達水平

qRT-PCR與Western blotting法驗證重組慢病毒介導(dǎo)CDCA2基因沉默效果，結(jié)果顯示，與Lv-NC組相比，Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞中CDCA2 mRNA及蛋白表達水平均顯著降低（

P

＜0.05），而對照組與Lv-NC組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P＞

0.05），見圖2，表2。

圖2 各組MCF-7細胞中CDCA2蛋白表達條帶

表2 MCF-7細胞中CDCA2表達/±s

2.3 沉默CDCA2對MCF-7細胞增殖的影響

MTT實驗檢測沉默CDCA2對MCF-7細胞增殖的影響，結(jié)果顯示，相對于Lv-NC組，Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞增殖活性顯著降低（

P

＜0.05），Western blotting實驗 結(jié) 果顯示Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞中Cyclin D1、CDK4蛋白水平顯著低于Lv-NC組（

P

＜0.05），而P21蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），見圖3，表3。

表3 沉默CDCA2對MCF-7細胞增殖的影響/±s

圖3 各組乳腺癌細胞MCF-7細胞增殖相關(guān)蛋白表達條帶

2.4 沉默CDCA2對MCF-7細胞克隆形成能力的影響

克隆形成實驗結(jié)果對照組、Lv-NC組、Lv-siRNA-CDCA2組克隆形成率分別為（46.31±5.98）%、（43.27±5.81）%、（12.34±1.25）%，相對于Lv-NC組，Lv-siRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞克隆形成率顯著降低（

F

=134.209，

P

＜0.05）。

2.5 CDCA2基因?qū)β闶笠浦擦錾L的影響

裸鼠移植瘤實驗結(jié)果顯示，與Lv-NC組比較，Lv-siRNA-CDCA2組移植瘤體積和體質(zhì)量均顯著降低（

P

＜0.05）；對照組體積、體質(zhì)量比較差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖4。

圖4 各組裸鼠腫瘤生長

2.6 沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響

流式細胞術(shù)檢測沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響，結(jié)果顯示，Lv-siRNA-CDCA2組細胞凋亡率顯著升高（

P

＜0.05），Western blotting實驗結(jié)果顯示，LvsiRNA-CDCA2組乳腺癌MCF-7細胞Bcl-2蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），而Bax蛋白水平顯著升高（

P

＜0.05），見圖5，表4。

圖5 沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響：A為各組MCF-7細胞流式凋亡圖；B為各組MCF-7細胞凋亡相關(guān)蛋白表達條帶

表4 沉默CDCA2對MCF-7細胞凋亡的影響/±s

3 討論

乳腺癌細胞增殖與凋亡失衡及細胞遷移、侵襲能力增強可促進該疾病發(fā)生及發(fā)展，但關(guān)于其具體作用機制尚未完全闡明。因而深入探究基因通過哪種途徑促進乳腺癌細胞增殖、遷移及侵襲有助于揭示乳腺癌致病機制。研究表明抑制Jab1表達可抑制乳腺癌細胞增殖及遷移。慢病毒介導(dǎo)的SGK3基因沉默可影響乳腺癌細胞增殖及凋亡等生物學(xué)過程。相關(guān)研究報道指出慢病毒介導(dǎo)MRPS23基因沉默可促進乳腺癌細胞凋亡。因此，本研究積極探尋新型基因與乳腺癌細胞增殖及凋亡等生物學(xué)行為的關(guān)系，為揭示乳腺癌致病機制提供新方向。

CDCA2基因可通過調(diào)控蛋白磷酸酶1γ依賴的DNA損傷進而調(diào)控細胞周期進程，研究表明CDCA2基因在多種惡性腫瘤中均呈高表達，其高表達量與患者臨床病理分期及其相關(guān)臨床病理特征密切相關(guān)，沉默CDCA2基因表達可誘導(dǎo)細胞周期阻滯，并可抑制腫瘤細胞增殖并促進細胞凋亡。研究表明CDCA2基因在卵巢上皮癌中的表達水平明顯增高，其可通過促進細胞增殖及抑制細胞凋亡發(fā)揮促癌基因功能。本研究結(jié)果表明CDCA2基因在乳腺癌細胞中的表達水平明顯升高，通過慢病毒介導(dǎo)沉默CDCA2基因表達后，乳腺癌細胞中CDCA2基因表達水平顯著降低，進一步研究顯示沉默CDCA2基因表達后乳腺癌細胞增殖能力明顯降低，Cyclin D1、CDK4蛋白水平明顯降低，而P21蛋白水平明顯升高，已有研究報道指出Cyclin D1與CDK4形成Cyclin-CDK復(fù)合物進而正向調(diào)控細胞周期進程，促進細胞增殖，P21在多種惡性腫瘤中均呈低表達，并可抑制細胞周期依賴性激酶活性而抑制Cyclin-CDK復(fù)合物形成進而抑制腫瘤細胞增殖，且具有抑癌作用。提示沉默CDCA2基因表達可通過促進P21表達及抑制Cyclin D1、CDK4表達進而抑制乳腺癌細胞增殖。Bcl-2屬于原癌基因并可抑制細胞凋亡，Bax是促凋亡基因并可促進細胞凋亡。本研究結(jié)果表明沉默CDCA2基因表達可促進乳腺癌細胞凋亡，Bax表達上調(diào)，而Bcl-2表達下調(diào)，說明沉默CDCA2基因可通過激活細胞凋亡基因Bax表達而抑制原癌基因Bcl-2表達。提示沉默CDCA2基因誘導(dǎo)乳腺癌細胞凋亡可能是通過調(diào)控細胞凋亡基因表達而發(fā)揮作用。同時本研究通過裸鼠移植瘤實驗發(fā)現(xiàn)沉默CDCA2基因可降低移植瘤體質(zhì)量及減輕移植瘤體積，提示沉默CDCA2基因可抑制乳腺癌生長。

綜上所述，慢病毒介導(dǎo)的RNAi沉默CDCA2基因感染乳腺癌細胞可有效下調(diào)CDCA2基因表達，并可通過調(diào)控細胞周期及細胞凋亡相關(guān)蛋白表達進而抑制乳腺癌細胞增殖并誘導(dǎo)細胞凋亡，可為乳腺癌的基因治療提供理論依據(jù)，為揭示乳腺癌致病機制奠定理論基礎(chǔ)。