乏氧環(huán)境對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

余自淑，田莉，陸靜，李濤

子宮肌瘤是女性生殖系統(tǒng)常見(jiàn)的良性腫瘤疾 病，病人發(fā)病率較高，多伴有子宮出血、腰背酸痛、流產(chǎn)、不孕等，嚴(yán)重影響了病人的生活質(zhì)量。子宮動(dòng)脈栓塞術(shù)（uterine artery embolization，UAE）治療子宮肌瘤在臨床上的應(yīng)用表明，乏氧環(huán)境能夠誘發(fā)子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡。在多種腫瘤中存在乏氧、低養(yǎng)分和pH的現(xiàn)象，腫瘤內(nèi)乏氧促進(jìn)一些轉(zhuǎn)錄因子活化，促進(jìn)腫瘤細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞自噬，是腫瘤惡化轉(zhuǎn)移的重要因素。子宮肌瘤細(xì)胞中自噬作用存在明顯異常，自噬屬于細(xì)胞的一種凋亡方式，其與腫瘤的發(fā)生有著密切關(guān)系。因此，本研究對(duì)乏氧環(huán)境對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)的影響進(jìn)行了探究，具體如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取成都市第三人民醫(yī)院2017年11月至2018年11月收治的20例子宮肌瘤病人，年齡范圍32～53歲，年齡（38.2±2.7）歲，病人通過(guò)肌瘤切除術(shù)或腹腔鏡檢查獲得子宮肌瘤和周邊正常平滑肌組織樣本各2 g，迅速放置于無(wú)菌冰凍試管中，-80℃冰箱中保存待測(cè)，其中子宮肌瘤組織樣本作為觀察組，周邊正常平滑肌組織樣本作為對(duì)照組。病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 納入及排除標(biāo)準(zhǔn)

納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）術(shù)前常規(guī)行宮頸細(xì)胞學(xué)檢查診斷為子宮肌瘤；（2）均為首次發(fā)病病人；（3）所有病人均同意收集組織標(biāo)本并簽署知情同意書；（4）均經(jīng)腹腔鏡及病理檢查確診。

排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）納入研究前6個(gè)月內(nèi)未采用類固醇激素藥物；（2）惡性腫瘤病人；（3）合并子宮肌腺癥、肝腎功能異常、凝血功能障礙等病人。

1.3 方法

1.3.1 原代細(xì)胞培養(yǎng)將留取的子宮肌瘤組織和子宮平滑肌組織，采用含鏈霉素（1 000 μg/mL）和青霉素（1 000 U/mL）的平衡無(wú)機(jī)鹽溶液（hank's balanced salt solutions，HBSS）清洗3次，將組織剪碎，加入8 mL的0.4%膠原酶，于恒溫箱內(nèi)37℃消化150 min。至小絮狀或肉眼不可見(jiàn)時(shí)，過(guò)濾、離心（以1 000 r／min，離心5 min，r=12 cm），收集細(xì)胞。隨后加入50 mL含10%FBS的DMEM-F12（100 μg/mL鏈霉素，100 U/mL青霉素）重懸，5%二氧化碳及37℃條件下孵育培養(yǎng)。24 h后細(xì)胞貼壁進(jìn)行換液，細(xì)胞融合達(dá)80%后采用0.25%胰蛋白酶-EDTA消化傳代，經(jīng)3次純化后仍未貼壁的為子宮肌瘤細(xì)胞或子宮平滑肌細(xì)胞。

1.3.2 細(xì)胞增殖測(cè)定采用SRB染色法測(cè)定細(xì)胞增值率，將子宮肌瘤細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞接種于96孔板上，3 000細(xì)胞/孔，于5%二氧化碳、1%氧氣培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，分別于培養(yǎng)0 h、6 h、12 h、24 h及48 h取樣檢測(cè)細(xì)胞增值率。細(xì)胞增值率（%）=每階段實(shí)測(cè)細(xì)胞數(shù)/初始接種數(shù)×100%。

1.3.3 細(xì)胞凋亡檢測(cè)采用Annexin V/核酸染色測(cè)定。采用流式細(xì)胞分析儀（購(gòu)自美國(guó)BD公司）檢測(cè)細(xì)胞凋亡情況，將第3代子宮肌瘤細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞接種于6孔板上，得密度為6×10細(xì)胞/孔細(xì)胞懸液，經(jīng)0.25%胰蛋白酶-EDTA酶化固定，經(jīng)PBS洗2次，收集細(xì)胞。加入FITC標(biāo)記的Annexin V室溫避光30 min，再加碘化丙啶（PI），避光反應(yīng)5 min后，加入適量緩沖液（Buffer），上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)（具體步驟參照試劑盒說(shuō)明書）。

1.3.4 增殖指標(biāo)測(cè)定采用Western blotting法測(cè)定，將第3代子宮肌瘤細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞接種于6孔板上，細(xì)胞培養(yǎng)值融合80%～90%，提取細(xì)胞總蛋白，并以25微克/孔凝膠電泳，將獲得的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)移至NC膜，室溫下5%脫脂奶粉封閉，1 h后采用TBST反復(fù)漂洗3次，加入PR兔源多克隆抗體（1∶800），4℃條件下過(guò)夜，然后加入紅色熒光標(biāo)記的二抗免疫球蛋白G（IgG）（1∶4 000），TBST漂洗，以β-肌動(dòng)蛋白（βactin）為內(nèi)參照，采用Odyssey熒光成像系統(tǒng)對(duì)各條帶吸光度值進(jìn)行掃描分析，并計(jì)算子宮肌瘤細(xì)胞孕激素受體A/B（PR-A/B）、孕激素受體M（PR-M）、低氧誘導(dǎo)因子-1（HIF-1）及孔蛋白（porin）相對(duì)表達(dá)量。

1.3.5 自噬蛋白測(cè)定采用Western blotting檢測(cè)，取適量第3代子宮肌瘤細(xì)胞和平滑肌細(xì)胞樣本與液氮中研磨成粉后加入到磷酸酶及蛋白酶抑制劑裂解液中，離心取上清，定量變性，將獲得的蛋白質(zhì)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉，隨后分別加入一抗及二抗孵育，熒光成像系統(tǒng)掃描分析，并測(cè)定程序性死亡受體-1（programmed cell death-1，PD-1）、酵母自噬相關(guān)基因（Beclin-1）、選擇性自噬接頭蛋白（P62）及微管相關(guān)蛋白1輕鏈3-Ⅱ（microtubule associated protein light chain 3-1Ⅱ，LC3-Ⅱ）相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增值率比較

隨著時(shí)間增加，兩組細(xì)胞增值率均顯著下降（

P

＜0.05）。培養(yǎng)0 h及6 h，兩組細(xì)胞增值率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；培養(yǎng)12 h開(kāi)始至48 h，兩組細(xì)胞增值率明顯降低，且觀察組細(xì)胞增值率更低于對(duì)照組（

P

＜0.05），見(jiàn)表1。

表1 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞增值率比較/x±s

2.2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較

隨著時(shí)間增加，兩組細(xì)胞凋亡率不斷增加（

P

＜0.05）；且6 h、12 h、24 h、48 h觀察組細(xì)胞凋亡率均顯著高于對(duì)照組（

P

＜0.05），見(jiàn)表2。

表2 兩組不同時(shí)間點(diǎn)細(xì)胞凋亡率比較/（%，x±s）

2.3 兩組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白表達(dá)比較

培養(yǎng)0 h，觀察組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白表達(dá)均顯著高于對(duì)照組（

P

＜0.05）；培養(yǎng)48 h后，觀察組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），而對(duì)照組各蛋白水平無(wú)明顯變化（

P

＞0.05），見(jiàn)表3。

表3 兩組PR-A/B、PR-M及porin蛋白相對(duì)表達(dá)量比較/x±s

2.4 兩組Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ蛋白表達(dá)情況比較

培養(yǎng)0 h，觀察組Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ水平均顯著低于對(duì)照組（

P

＜0.05）；培養(yǎng)48 h，觀察組觀察組各蛋白水平明顯升高（

P

＜0.05），而觀察組無(wú)明顯變化（

P

＞0.05）。見(jiàn)表4。

表4 兩組Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ蛋白相對(duì)表達(dá)量比較/x±s

3 討論

子宮肌瘤是一種危害較大的婦科良性腫瘤，臨床研究發(fā)現(xiàn)，UAE術(shù)通過(guò)阻斷子宮動(dòng)脈，使子宮肌瘤細(xì)胞處于缺氧、缺血狀態(tài)，促使肌瘤細(xì)胞凋亡。本研究探究了乏氧環(huán)境對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖和凋亡的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，隨著時(shí)間增加，兩組細(xì)胞增值率均顯著下降（

P

＜0.05）。培養(yǎng)0 h及6 h，兩組細(xì)胞增值率比較差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）；培養(yǎng)12 h開(kāi)始至48 h，觀察組細(xì)胞增值率低于對(duì)照組（

P

＜0.05）。隨著時(shí)間增加，兩組細(xì)胞凋亡比例不斷增加（

P

＜0.05）；且6 h、12 h、24 h、48 h觀察組細(xì)胞凋亡比例均顯著高于對(duì)照組（

P

＜0.05）。提示，乏氧環(huán)境明顯抑制了子宮肌瘤細(xì)胞的增殖并促進(jìn)了子宮肌瘤細(xì)胞的凋亡。這也說(shuō)明，子宮肌瘤組織對(duì)于缺氧條件更加敏感，其生長(zhǎng)更容易受到抑制。孕激素受體和porin是子宮肌瘤重要的預(yù)測(cè)和預(yù)后因子，其表達(dá)水平與子宮肌瘤病人治療效果和預(yù)后密切相關(guān)，孕激素受體是配體激活核轉(zhuǎn)錄因子超家族的一員，孕激素受體A和B在子宮肌瘤細(xì)胞中的表達(dá)水平明顯高于周邊正常組織，并與孕激素受體M的作用有著密切關(guān)系，孕激素受體M能夠抑制子宮平滑肌細(xì)胞、乳腺癌細(xì)胞等的凋亡，在子宮肌瘤的生長(zhǎng)中發(fā)揮著促進(jìn)作用，PR-M與孕激素結(jié)合能夠促進(jìn)平滑肌細(xì)胞MMP升高，促使細(xì)胞代謝及呼吸作用增強(qiáng)，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)細(xì)胞異常增殖。HIF-1是介導(dǎo)細(xì)胞低氧反應(yīng)的關(guān)鍵核轉(zhuǎn)錄因子，能夠調(diào)控細(xì)胞增殖而參與子宮肌瘤的發(fā)生與發(fā)展，其存在α和β兩個(gè)亞基，以α亞基活性最強(qiáng)，HIF-1α是修復(fù)細(xì)胞氧內(nèi)環(huán)境和誘導(dǎo)乏氧基因的核心調(diào)節(jié)因子，在腫瘤壞死區(qū)表達(dá)顯著增高，并具有促進(jìn)腫瘤轉(zhuǎn)移和侵襲、降低放化療敏感性等效應(yīng)，已經(jīng)成為腫瘤治療的重要靶點(diǎn)。Porin能夠誘導(dǎo)細(xì)胞代謝及凋亡，通過(guò)研究PR-A/B、PR-M及porin在乏氧環(huán)境下子宮肌瘤細(xì)胞中的變化可以了解乏氧環(huán)境對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖、凋亡的影響作用。本研究結(jié)果顯示，子宮肌瘤細(xì)胞中PR-A/B、PR-M及porin蛋白表達(dá)均顯著高于子宮平滑肌細(xì)胞。提示，子宮肌瘤細(xì)胞中PR-A/B、PR-M及porin表達(dá)異?；钴S，而通過(guò)乏氧處理，觀察組PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白水平顯著降低（

P

＜0.05），而對(duì)照組各蛋白水平無(wú)明顯變化（

P

＞0.05）。提示，乏氧處理顯著降低了子宮肌瘤細(xì)胞中PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin表達(dá)水平，側(cè)面反映了乏氧處理抑制了子宮肌瘤細(xì)胞的增殖，研究認(rèn)為，缺氧條件促使肌瘤細(xì)胞線粒體內(nèi)源性凋亡程序啟動(dòng)，線粒體在鈣離子、Bcl-2等蛋白的調(diào)控下釋放Cytc等分子激活caspases級(jí)聯(lián)反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。因此，乏氧環(huán)境能夠通過(guò)促進(jìn)線粒體凋亡減少子宮肌瘤細(xì)胞中PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin蛋白表達(dá)，從而促進(jìn)細(xì)胞凋亡。而乏氧對(duì)子宮平滑肌細(xì)胞作用不明顯，原因可能是子宮平滑肌細(xì)胞PR-A/B、PR-M、HIF-1α及porin水平原本就較低術(shù)后，受抑制不明顯。

子宮肌瘤細(xì)胞凋亡明顯降低，這也說(shuō)明細(xì)胞正常凋亡能夠抑制子宮肌瘤的形成。凋亡為機(jī)體細(xì)胞的程序性死亡，是機(jī)體維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，清除受損細(xì)胞的重要方式；當(dāng)程序性死亡過(guò)程被破壞，受損或基因變異時(shí)，細(xì)胞會(huì)繼續(xù)復(fù)制，導(dǎo)致腫瘤的發(fā)生。自噬是細(xì)胞的溶酶體降解途徑，細(xì)胞通過(guò)囊泡包裹受損細(xì)胞器及部分胞漿并運(yùn)送至溶酶體分解，形成的多數(shù)大分子產(chǎn)物得以被重新利用。自噬作用即細(xì)胞Ⅱ型程序性死亡，其參與了機(jī)體生長(zhǎng)、代謝和發(fā)育的多個(gè)過(guò)程，對(duì)于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定和抑制腫瘤的產(chǎn)生有著重要的作用。Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ是自噬的標(biāo)志性蛋白，其水平變化反映了自噬能力的增強(qiáng)或減弱。Beclin-1能夠與PI3KC3相互作用促進(jìn)自噬體形成，Beclin-1失活會(huì)促進(jìn)缺氧誘導(dǎo)的血管形成。LC3-Ⅱ是自噬作用的標(biāo)志分子，當(dāng)自噬形體形成時(shí)，胞質(zhì)型LC3會(huì)酶解形成LC3-Ⅱ。p62是一種多結(jié)構(gòu)域的自噬底物連接蛋白，其能與待降解蛋白結(jié)合并運(yùn)送至噬泡中降解，正常機(jī)體中，p62蛋白隨著自噬過(guò)程而逐漸降解，其與自噬體和溶酶體數(shù)量有著顯著正相關(guān)性。自噬和凋亡都是細(xì)胞程序性死亡的正常方式，腫瘤細(xì)胞中程序性死亡受抑制，自噬也會(huì)受到抑制，而乏氧條件下能夠促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，其與腫瘤細(xì)胞乏氧狀態(tài)下自噬作用重新激活可能存在密切關(guān)系。本研究發(fā)現(xiàn)，子宮肌瘤細(xì)胞中Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ水平均顯著低于子宮平滑肌細(xì)胞，提示子宮肌瘤細(xì)胞自噬作用明顯受限。而通過(guò)乏氧處理，子宮肌瘤細(xì)胞中Beclin-1、P62及LC3-Ⅱ水平明顯增加，促使自噬體生成速度增加，并提升溶酶體降解速度，增加自噬體蓄積。提示乏氧處理能夠增強(qiáng)子宮肌瘤細(xì)胞自噬作用，進(jìn)而發(fā)揮溶酶體的降解作用，促進(jìn)子宮肌瘤細(xì)胞的降解凋亡。

乏氧環(huán)境對(duì)于子宮肌瘤細(xì)胞的影響及機(jī)制尚需要進(jìn)一步研究，對(duì)于乏氧環(huán)境對(duì)子宮肌瘤細(xì)胞增殖和自噬相關(guān)蛋白的影響可以為子宮肌瘤的治療提供理論依據(jù)。但除此之外，其中還可能存在其他因素，對(duì)于乏氧環(huán)境下子宮肌瘤細(xì)胞和子宮平滑肌細(xì)胞的變化還需繼續(xù)深入了解。