牙種植體周圍黏膜炎齦溝液中低氧誘導因子-1α、基質(zhì)金屬蛋白酶-2的水平及意義

李雋，尹霜霜，譚為聰，余留先

牙種植體周圍黏膜炎是發(fā)生在種植體周圍軟組織的可逆性炎癥，若治療不及時，會因炎癥進展迅速造成支持骨喪失，進一步發(fā)展為種植體周圍炎，導致種植體修復失敗。目前認為種植體周圍黏膜炎是由菌斑生物膜引發(fā)的炎癥反應、特異性免疫和非特異性免疫防御機制過程造成的疾病。低氧誘導因子-1α（hypoxia inducible factor-1ɑ，HIF-1α）是低氧誘導因子-1的組成亞基之一，是低氧應激反應的關鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)因子，可激活宿主免疫反應，并與產(chǎn)生的基質(zhì)金屬蛋白酶一同參與牙周組織的破壞、降解過程。基質(zhì)金屬蛋白酶-2（matrix metalloproteinase-2，MMP-2）屬于底物為明膠及Ⅳ/Ⅴ型膠原的明膠酶類，可降解壞死組織的膠原纖維，并促進組織重建，參與牙周膜細胞外基質(zhì)的降解及牙周組織更新過程。目前，種植體周圍黏膜炎齦溝液中HIF-1α、MMP-2的研究相對較少。因此本研究將通過檢測種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2的表達水平，探討兩者在種植體周圍黏膜炎發(fā)病機制中的作用及意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2017年9月至2019年6月在湖南中醫(yī)藥高等專科學校附屬第一醫(yī)院收治的種植體周圍黏膜炎病人（黏膜炎組）46例作為研究對象，同時選取種植體周圍炎病人（周圍炎組）48例，同期種植體周圍牙齦健康者（健康組）50例。收集三組基線資料，包括性別、年齡、體質(zhì)量指數(shù)（BMI），經(jīng)統(tǒng)計學分析和比較，均差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05），具有可比性，見表1。

表1 三組基線資料比較

種植體周圍黏膜炎病人納入標準：（1）種植體周圍探診有出血或溢膿但無骨組織吸收；（2）病人或其近親屬知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關要求，并簽署紙質(zhì)版知情同意書。排除標準：（1）有全身性疾病、種植體周圍其他疾病者；（2）3個月內(nèi)有牙周組織疾病治療史或口服抗生素、免疫抑制劑、避孕類藥物者；（3）1個月內(nèi)用抑制菌斑的藥物漱口或內(nèi)服用抗菌類藥物者；（4）提取樣本期間處于月經(jīng)期、妊娠期或哺乳期者；（5）依從性差、不能按時復診者；（6）有吸煙史者；（7）口腔衛(wèi)生極差者。

種植體周圍炎判定標準：種植體周圍探診有出血或溢膿且有骨組織吸收。

1.2 試劑與儀器

人HIF-1α、MMP-2、白細胞介素-1β（IL-1β）、超氧化物歧化酶（SOD）、丙二醛（MDA）酶聯(lián)免疫（ELISA）檢測試劑盒（貨號分別為YYSJH-1119、YYSJH-1277、YYSJH-139、YYSJH-974、YY-20174）購自上海優(yōu)予生物科技有限公司；人核因子-κB（NF-κB）ELISA檢測試劑盒（貨號CD-103606-ELISA）購自武漢純度生物科技有限公司；酶標儀（型號MODEL550）購自美國Bio-Rad公司。

1.3 齦溝液標本的收集

制作2 mm×20 mm的濾紙條，高溫高壓消毒后備用。無菌干棉球拭干牙面，無菌棉卷隔濕，將消毒好的濾紙條輕輕插入，1 min后取出（有唾液或血液污染者棄掉重新取樣）。插入30 s后取出，每個種植體分別取頰（唇）側近遠中2個位點，取相同長度（2 mm）的濾紙條放入盛有200 μL PBS緩沖液的Eppendorf管中并震蕩30 min，在4℃低溫條件下10 000 r/min離心10 min，取上清液放入-70℃冰箱內(nèi)備用。

1.4 齦溝液中HIF-1α、MMP-2、IL-1β、NF-κB、SOD、MDA表達水平檢測

從-70℃冰箱中取出備檢樣本在室溫下放置20 min，ELISA法檢測齦溝液中PTX3、IL-6、IL-10、TNF-α、NF-κB的表達水平，試驗方法均按照相應試劑盒說明書進行。使用酶標儀在450 nm波長處測定吸光度值，根據(jù)繪制的標準曲線計算HIF-1α、MMP-2、IL-1β、NF-κB、SOD、MDA的表達水平。

1.5 牙周檢查指標

（1）菌斑指數(shù)（plaque index，PLI）：根據(jù)菌斑堆積量分為4級，齦緣區(qū)無菌斑記為0分；視診無菌斑，但在游離齦及鄰近區(qū)可用探針可刮出薄層菌斑記為1分；游離齦區(qū)、鄰近牙面或齦袋內(nèi)可見中等堆積量的軟性沉積物記為2分；游離齦區(qū)及鄰近牙面或齦袋內(nèi)有大量軟性沉積物記為3分。（2）牙齦指數(shù)（gingival index，GI）：根據(jù)牙齦病變程度分為4級，牙齦正常記為0分；牙齦輕度炎癥，輕度水腫，顏色輕度改變，探診不出血記為1分；牙齦中度炎癥，水腫、顏色明顯發(fā)紅、有光亮，探診出血記為2分；牙齦炎癥明顯，紅腫，有自動出血、潰瘍傾向記為3分。（3）齦溝出血指數(shù)（sulcus bleeding index，SBI）：根據(jù)齦溝出血程度分為4級，齦溝不出血記為1分；輕探齦溝時出血，齦外觀正常記為2分；探齦溝時出血，牙齦變紅，無腫脹癥狀記為3分；牙齦有潰瘍或其他癥狀記為4分。（4）探診深度（probingdepth，PD）：以25 g左右的探診力量探測齦緣到牙周袋底或齦溝底的距離，每個種植體探診舌側近中、中央、遠中和頰近中、中央、遠中6個部位，取平均值記為PD值。所有檢測均由同一名醫(yī)生完成。

2 結果

2.

1

三組種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平

三組種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平均差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。與健康組相比，黏膜炎組、周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平明顯升高（

P

＜0.05）；與黏膜炎組相比，周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2水平明顯升高（

P

＜0.05）。見表2。

表2 三組種植體周圍齦溝液中HIF-1ɑ、MMP-2表達水平比較/（xˉ±s，μg/L）

2.2 三組種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、SOD、MDA水平

三組種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、SOD、MDA水平均差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。與健康組相比，黏膜炎組、周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、MDA水平明顯升高（

P

＜0.05），SOD水平明顯降低（

P

＜0.05）；與黏膜炎組相比，周圍炎組病人種植體周圍齦溝液中IL-1β水平差異無統(tǒng)計學意義（

P

＞0.05），NF-κB、MDA水平明顯升高（

P

＜0.05），SOD水平明顯降低（

P

＜0.05）。見表3。

表3 三組種植體周圍齦溝液中IL-1β、NF-κB、SOD、MDA表達水平比較/（μg/L，±s）

2.3 三組PLI、GI、SBI、PD值

三組PLI、GI、SBI、PD值均差異有統(tǒng)計學意義（

P

＜0.05）。與健康組相比，黏膜炎組、周圍炎組病人PLI、GI、SBI、PD值明顯升高（

P

＜0.05）；與黏膜炎組相比，周圍炎組病人PLI、GI、SBI、PD值明顯升高（

P

＜0.05）。見表4。

表4 三組PLI、GI、SBI、PD值比較/±s

2.4 種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平與IL-1β、NF-κB、SOD、MDA的相關性分析

相關性分析結果顯示，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平與IL-1β、NF-κB水平均明顯正相關（

P

＜0.05），與SOD水平均明顯負相關（

P

＜0.05），HIF-1α水平與MDA水平正相關不明顯（

P

＞0.05），MMP-2水平與MDA水平顯著正相關（

P

＜0.05）。見表5。

表5 HIF-1α、MMP-2水平與IL-1β、NF-κB、SOD、MDA的相關性分析

2.5 種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水 平與PLI、GI、SBI、PD的 相關性 分析

相關性分析結果顯示，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平與PLI、GI、SBI、PD值均明顯正相關（

P

＜0.05）。見表6。

表6 HIF-1α、MMP-2水平與PLI、GI、SBI、PD的相關性分析

2.6 種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平預測種植體周圍炎的效能分析

種植體周圍黏膜炎預測是否發(fā)展為種植體周圍炎，齦溝液中HIF-1α水 平的ROC曲 線下面 積為0.663（95%

CI

：0.554～0.773），截 斷 值 為527.88 μg/L，敏 感 度 為62.5%，特異性為65.2%；齦溝液中MMP-2水平的ROC曲線下面積為0.736（95%

CI

：0.637～0.836），截斷值為11.940 μg/L，敏感度為85.4%，特異性為52.2%；兩者聯(lián)合預測曲線下面積為0.799（95%

CI

：0.708～0.890），敏感度為68.8%，特異性為87.0%。見圖1。

圖1 齦溝液中HIF-1α、MMP-2水平的ROC曲線分析

3 討論

種植體周圍黏膜炎、周圍炎都是由菌斑引起的種植牙常見并發(fā)癥，其中，種植體周圍黏膜炎病變局限于種植體周圍的軟組織，具有可逆性，其發(fā)生過程伴隨著炎癥反應、氧化應激反應的發(fā)生；若病變繼續(xù)發(fā)展成周圍炎，會導致骨喪失，進而發(fā)生種植體松動脫落。據(jù)統(tǒng)計，種植體周圍黏膜炎發(fā)病率達83.6%，種植體周圍黏膜炎及其晚期表現(xiàn)周圍炎的發(fā)生是造成種植義齒修復失敗的主要原因，早期診斷并治療將有利于種植體長期穩(wěn)定。所以，尋找預測種植體周圍黏膜炎發(fā)生發(fā)展的生物標志物，是及時采取治療、保證種植體長期穩(wěn)定的關鍵。

HIF-1α是細胞進行低氧適應并調(diào)節(jié)應答的關鍵因子，對多種炎性因子均有促進作用，參與多種疾病的發(fā)病過程。有研究表明，牙周炎中HIF-1α的表達明顯高于正常病人，可能與牙周炎發(fā)生密切相關。王瑢等通過糾正牙周炎組織的缺氧狀態(tài)，降低HIF-1α平均陽性細胞率，達到了緩解牙周炎的目的。李坤陽等通過建立大鼠牙周炎模型，降低牙周炎HIF-1α陽性表達，減輕牙周炎癥程度，取得很好的治療效果。本研究結果表明，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α水平明顯上調(diào)，與炎性因子IL-1β、NF-κB水平、反映疾病情況的PLI、GI、SBI、PD值明顯正相關，與氧化應激指標SOD水平明顯負相關，預后發(fā)展的ROC曲線下面積為0.663（95%

CI

：0.554～0.773），敏感度為62.5%，特異性為65.2%。提示種植體周圍黏膜炎齦溝液HIF-1α水平可能與疾病發(fā)生有關，且與炎性因子水平、氧化應激指標相關性明顯，可能通過炎癥、氧化應激共同影響疾病，且對預后種植體周圍黏膜炎發(fā)展具有一定價值。MMP-2是能降解細胞外基質(zhì)的蛋白水解酶，常表達于成纖維細胞和破骨細胞中，其表達能通過炎癥早期釋放的炎癥介質(zhì)誘導增加，并通過降解細胞外基質(zhì)促進炎癥細胞的進一步浸潤，在牙周組織正常改建方面起重要作用。王雙雙研究表明，降低牙周炎病人齦溝液中IL-1β、TNF-ɑ和MMP-2的濃度能治療牙周炎。本研究結果顯示，種植體周圍黏膜炎齦溝液MMP-2表達水平明顯上調(diào)，與IL-1β、NF-κB、MDA水平、PLI、GI、SBI、PD值明顯正相關，與SOD水平明顯負相關，預后的ROC曲線下面積為0.736（95%

CI

：0.637～0.836），敏感度為85.4%，特異性為52.2%。這表明齦溝液MMP-2水平的升高可能與疾病發(fā)生發(fā)展有關，其作用機制可能與炎癥、氧化應激有關，預后種植體周圍黏膜炎發(fā)展的敏感度較高。研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)生低氧、牙周炎時，HIF-1α可能通過調(diào)控MMP-2表達，參與血管生成、細胞遷移及傷口愈合等多種病理生理過程，在牙周組織發(fā)揮重要作用。本研究結果表明，齦溝液HIF-1α、MMP-2水平聯(lián)合檢測的ROC曲線下面積為0.799（95%

CI

：0.708～0.890），敏感度為68.8%，特異性為87.0%。提示與單因子預測疾病發(fā)展相比，兩者聯(lián)合預測能提高曲線下面積和特異性，對預后有更高的診斷價值。

綜上所述，種植體周圍黏膜炎病人齦溝液中HIF-1α、MMP-2明顯高表達，與種植體周圍黏膜炎的發(fā)展程度密切相關，且與炎癥、氧化應激和種植體周指標關系密切，可能對種植體周圍黏膜炎預后具有重要意義。但本研究存在不足：樣本量較小，仍需進一步擴大樣本量。