腸道病毒71型感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞中EV71 3C活性與NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的關(guān)聯(lián)

魏容，肖光軍，劉艷婷，楊娜

腸道病毒71型（Enterovirus Type 71，EV71）是已知的可引發(fā)嬰幼兒發(fā)生手足口病的主要病原體，是人類(lèi)A型腸道病毒中屬于核糖核酸病毒科中的腸道病毒屬。其基因組主要為單股正鏈的RNA，其長(zhǎng)度可達(dá)到7 400個(gè)核苷酸，EV71最早發(fā)現(xiàn)于患有中樞神經(jīng)系統(tǒng)障礙的加利福尼亞嬰兒的糞便中。報(bào)道指出，EV71的分布區(qū)域主要是星形膠質(zhì)細(xì)胞的細(xì)胞核和細(xì)胞漿內(nèi)，大部分分布于細(xì)胞漿，少部分在細(xì)胞核；脊髓前角炎癥的炎癥細(xì)胞和神經(jīng)元、腦干等部位也有分布，推測(cè)EV71可通過(guò)外周神經(jīng)對(duì)中樞神經(jīng)產(chǎn)生逆向感染。EV71 3C是一種半胱氨酸蛋白酶，由谷氨酸（glu）、半胱氨酸（cys147）和組氨酸（his40）構(gòu)成酶活性中心，其活性中心與病毒的發(fā)展有關(guān)聯(lián)。3C蛋白參與了病毒復(fù)制的幾乎所有過(guò)程，其具有穩(wěn)定、特殊的β-折疊的空間結(jié)構(gòu)，可作用于絲氨酸/半胱氨酸（Ser/Cys）。白細(xì)胞介素-6（IL-6）和白細(xì)胞介素-8（IL-8）已知的兩種重要因子，其表達(dá)的下調(diào)可促進(jìn)病原體的入侵。IL-6主要在急性反應(yīng)、造血調(diào)控、免疫應(yīng)答等方面具有顯著功效，當(dāng)其異常表達(dá)時(shí)可引發(fā)多種臨床疾?。籌L-8主要是能夠趨化炎癥細(xì)胞，促進(jìn)一系活性物質(zhì)的釋放，導(dǎo)致炎癥反應(yīng)的發(fā)生，達(dá)到促使異常細(xì)胞凋亡和殺菌的作用。目前，對(duì)于腸道病毒71型感染的研究報(bào)道很多，但對(duì)腸道病毒71型感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞中EV71 3C活性與細(xì)胞內(nèi)相關(guān)信號(hào)的傳導(dǎo)關(guān)系尚不明確，因此，2018年3月至2019年3月進(jìn)行本研究，旨在探究腸道病毒71型感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞中EV71 3C活性與核因子κB（nuclear factor kappa B，NF-κB）信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)效率的關(guān)聯(lián)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

EV71病毒于2012年從安徽阜陽(yáng)病毒感染治療實(shí)驗(yàn)室中一名重癥EV71感染的男童呼吸道的血性分泌物中分離得到，屬于C4亞型，其基因序列EU812515.1。星形膠質(zhì)細(xì)胞從本實(shí)驗(yàn)室分離獲?。ㄗⅲ涸摱局暌呀?jīng)經(jīng)過(guò)檢驗(yàn)確立為標(biāo)準(zhǔn)毒株）。

1.2 方法

像《摩西五經(jīng)》所規(guī)定的這種儀式的制度太嚴(yán)格了，他要求食品完全一致。其實(shí)摩西是把以色列的飲食神圣化、規(guī)格化了，使其完全同一。而中國(guó)的春節(jié)或其他節(jié)日，只有一樣相同，其他可以不同，如春節(jié)包餃子，元宵節(jié)吃元宵，端午節(jié)吃粽子，中秋節(jié)吃月餅，但是其他的菜肴則根據(jù)各地區(qū)、各家的喜好，自行安排。

1.2.1 星形膠質(zhì)細(xì)胞的原代培養(yǎng)取實(shí)驗(yàn)室新出生的SD乳鼠1～3 d，使用75%乙醇進(jìn)行消毒浸泡5 min左右。眼科剪取出大腦皮質(zhì)放置于含Hanks培養(yǎng)皿內(nèi)，剝離血管組織和腦膜，將大腦皮質(zhì)快速轉(zhuǎn)移至含DMEM培養(yǎng)液的無(wú)菌培養(yǎng)皿中剪碎并過(guò)濾，使用無(wú)菌玻璃器皿將腦組織進(jìn)一步碾碎，轉(zhuǎn)移至無(wú)菌培養(yǎng)瓶中，加入DMEM培養(yǎng)液后反復(fù)吹打使其形成單細(xì)胞懸液，加入小牛血清保證終濃度為20%，細(xì)胞濃度為2×10個(gè)/毫升，置于培養(yǎng)箱中進(jìn)行差速粘附處理，而后旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)瓶，將細(xì)胞懸液接種于含鼠尾膠原包被的培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，并在倒置顯微鏡下觀察其生長(zhǎng)狀態(tài)。

像王伯琦和蔡樞衡這些民國(guó)學(xué)者清晰地認(rèn)識(shí)到，社會(huì)本位對(duì)于中國(guó)而言，有其存在的價(jià)值和意義。但是，再好的東西也必須考慮到我們自己的實(shí)際情況。從內(nèi)心而言，他們也都認(rèn)可社會(huì)本位所追求的公共利益。然而，他們之所以提出不同的觀點(diǎn)，原因在于：第一，中國(guó)沒(méi)有個(gè)人權(quán)利觀念作為發(fā)展社會(huì)本位的根基，所以，拋開(kāi)個(gè)人本位，直接采社會(huì)本位法律實(shí)際上是在大躍進(jìn)，或者說(shuō)是急功近利。第二，因?yàn)橹袊?guó)封建傳統(tǒng)文化的影響，所以要采用社會(huì)本位作為中國(guó)法律本位，這種說(shuō)法沒(méi)有說(shuō)服國(guó)人的理論依據(jù)和可行性依據(jù)。而且，民國(guó)的一些學(xué)者之所以采社會(huì)本位，實(shí)則是在要求國(guó)人履行義務(wù)本位，放棄個(gè)人權(quán)利的實(shí)現(xiàn)。

1.2.2 星形膠質(zhì)細(xì)胞的傳代培養(yǎng)當(dāng)細(xì)胞鋪滿培養(yǎng)瓶底部，將原培養(yǎng)基棄除，使用胰酶消化1 min左右，迅速吸除胰酶，加入已配制的完全培養(yǎng)基，制成細(xì)胞懸液，按照要求將其分別加入到新的無(wú)菌培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，繼續(xù)培養(yǎng)。

方案提出，嚴(yán)禁幼兒園教授小學(xué)課程內(nèi)容。幼兒園不得布置幼兒完成小學(xué)內(nèi)容家庭作業(yè)、組織小學(xué)內(nèi)容有關(guān)考試測(cè)驗(yàn)；不得以舉辦興趣班、特長(zhǎng)班、實(shí)驗(yàn)班等為名進(jìn)行各種提前學(xué)習(xí)和強(qiáng)化訓(xùn)練活動(dòng)；不得進(jìn)行有損幼兒身心健康的比賽、表演或訓(xùn)練；不得擅自組織幼兒參加民間組織的競(jìng)賽、評(píng)獎(jiǎng)或者其他社會(huì)活動(dòng)。社會(huì)培訓(xùn)機(jī)構(gòu)不得以學(xué)前班、幼小銜接等名義提前教授小學(xué)內(nèi)容。糾正幼兒園以機(jī)械背誦、記憶、抄寫(xiě)、計(jì)算等方式進(jìn)行知識(shí)技能性強(qiáng)化訓(xùn)練等“小學(xué)化”教育方式，并整治“小學(xué)化”教育環(huán)境。

1.2.3 質(zhì)粒提取和轉(zhuǎn)染質(zhì)粒由深圳市默賽爾生物醫(yī)學(xué)科技發(fā)展有限公司構(gòu)建，利用氯化鈣法進(jìn)行感受態(tài)細(xì)胞制備，通過(guò)轉(zhuǎn)化和定點(diǎn)突變后，隨即進(jìn)行基因轉(zhuǎn)染，其中質(zhì)粒量和轉(zhuǎn)染試劑的比值按照1∶2.5進(jìn)行。

1.2.4 病毒TCID50的測(cè)定將星形膠質(zhì)細(xì)胞按照2×10個(gè)/孔，待其培養(yǎng)一天后接種病毒，加入10 mL稀釋液，滴加入96孔板中，每孔100 μL，當(dāng)其共同生長(zhǎng)2 h后吸除病毒液，轉(zhuǎn)用培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng)。觀察1周左右，根據(jù)公式T=10進(jìn)行病毒滴度計(jì)算。

2.3 EV71感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)細(xì)胞因子mRNA表達(dá)的作用

EV71感染后，細(xì)胞內(nèi)IL-6、IL-8、IL-12及IL-1β的表達(dá)均在12 h后顯著提高。見(jiàn)表2，3。

1.2.6 RNA提取和反轉(zhuǎn)錄PCR根據(jù)細(xì)胞內(nèi)RNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)操作步驟進(jìn)行細(xì)胞內(nèi)RNA提取，并采用脫氧核糖核酸酶（DNase）處理以去除DNA殘留。按照Invitrogen反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，得到最終產(chǎn)物cDNA。反轉(zhuǎn)錄反應(yīng)體系：Prime ScriptTM RT Enzyme Mix 1 μL；5×Prime ScriptTM Buffer 4 μL；Total RNA 1 μL；Oligo 50UM 1 μL；DdH2O 13 μL；Total 20 μL。將反轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物cDNA作為底物模板，進(jìn)行PCR反應(yīng)，并按照95℃3 min，95℃10 s，55℃5 s，68℃5 s，65～95℃5 s遞增的程序進(jìn)行產(chǎn)物擴(kuò)增。PCR體系：PCR Reverse Primer 1 μL；PCR Forward Primer 1 μL；SYBR Premix Ex TaqTM 12.5 μL；CDNA 1.5 μL；DdH2O 9 μL；Total 25 μL。

1.2.7 免疫共沉淀收集細(xì)胞，加入裂解液冰浴裂解30 min，20 000 r/min離心15 min。取上清液，按5∶1比例進(jìn)行加入上清液和上樣緩沖液，加熱變性。剩余上清中加入瓊脂糖珠（含偶聯(lián)抗體），4℃震蕩12 h。洗滌瓊脂糖珠后加入RIPA裂解液（RIPA Lysis Buffer），將其平分到樣品中，用PBS洗滌4次，加入上樣緩沖液，隨即進(jìn)行熱變性。

監(jiān)測(cè)計(jì)劃設(shè)計(jì)是明確監(jiān)測(cè)目的，并在調(diào)查研究的基礎(chǔ)上確定監(jiān)測(cè)項(xiàng)目，布設(shè)監(jiān)測(cè)網(wǎng)(點(diǎn))，合理安排采樣頻率和采樣時(shí)間，選擇采樣方法和分析測(cè)定技術(shù)，提出監(jiān)測(cè)報(bào)告要求，制定質(zhì)量控制和保證措施及實(shí)施計(jì)劃等。對(duì)監(jiān)測(cè)計(jì)劃設(shè)計(jì)的審核是審核工作的前提，目的是要把誤差消滅在源頭，使質(zhì)量保證工作與監(jiān)測(cè)工作同步進(jìn)行。

2.2 EV71感染對(duì)TAK1相關(guān)蛋白的影響

TGF-β活化激酶-1（TAK1）是已知介導(dǎo)NF-kB通路的主要調(diào)節(jié)蛋白，EV71 3C可用于TAK1蛋白的切割。EV71感染對(duì)細(xì)胞內(nèi)TAK1蛋白與其復(fù)合體蛋白的表達(dá)見(jiàn)圖1。

2 結(jié)果

2.4 EV71 3C切割導(dǎo)致TAKI復(fù)合體缺失對(duì)NF-kB的影響

TAB2可誘導(dǎo)NF-kB激活，而與3C共同表達(dá)時(shí)可顯著抑制NF-kB表達(dá)。EV71 3C可顯著抑制由TAK1復(fù)合體作用誘導(dǎo)NF-kB的激活。見(jiàn)表4。

表1 引物序列

1.2.8 Western blotting實(shí)驗(yàn)檢測(cè)蛋白表達(dá)將上述處理的樣品加入提前配制并凝固的電泳膠內(nèi)，進(jìn)行PAGE電泳。當(dāng)其條帶出現(xiàn)離底部1 cm左右，停止電泳，進(jìn)行蛋白轉(zhuǎn)膜實(shí)驗(yàn)。轉(zhuǎn)膜過(guò)程中保持低溫環(huán)境，當(dāng)?shù)鞍邹D(zhuǎn)移完全后，立即進(jìn)行封閉、抗體孵育，待抗體孵育后，可將其洗滌3次，加入顯色液，置于化學(xué)發(fā)光成像儀下進(jìn)行成像。

免疫共沉淀具體步驟：①轉(zhuǎn)染后24～48 h可收獲細(xì)胞，加入適量細(xì)胞裂解緩沖液（含蛋白酶抑制劑），冰上裂解30 min，細(xì)胞裂解液于4℃，最大轉(zhuǎn)速離心30 min后取上清；②取少量裂解液以備Western blotting分析，剩余裂解液加1 μg相應(yīng)的抗體加入到細(xì)胞裂解液，4℃緩慢搖晃孵育過(guò)夜；③取10 μL protein A瓊脂糖珠，用適量裂解緩沖液洗3次，每次3 000 r/min離心3 min；④將預(yù)處理過(guò)的10 μL protein A瓊脂糖珠加入到和抗體孵育過(guò)夜的細(xì)胞裂解液中4℃緩慢搖晃孵育2～4 h，使抗體與protein A瓊脂糖珠偶連；⑤免疫沉淀反應(yīng)后，在4℃以3 000 r/min速度離心3 min，將瓊脂糖珠離心至管底；將上清小心吸去，瓊脂糖珠用1 mL裂解緩沖液洗3～4次；加入2×SDS上樣緩沖液，沸水煮5 min；⑥聚丙烯酰胺凝膠電泳（PAGE），Western blotting或質(zhì)譜儀分析。通過(guò)免疫共沉淀確定結(jié)合蛋白。

由圖1可知，EV71感染可誘導(dǎo)TAK1和其復(fù)合體蛋白TAB123的降解，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，24h：TAB1（125.86±39.87），TAB2（352.12±42.36），TAB3（195.20±29.75）。但對(duì)于TRAF2和TBK1表達(dá)無(wú)影響。

圖1 EV71感染對(duì)星形膠質(zhì)細(xì)胞內(nèi)TAK1蛋白復(fù)合體的影響

1.2.5 EV71 3C活性測(cè)定將細(xì)胞以3×10個(gè)/孔接種于24孔板中，當(dāng)細(xì)胞生長(zhǎng)鋪滿瓶底成片時(shí)，即可進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染基因質(zhì)粒，分別為NF-κB、激活子蛋白-1（AP-1）和報(bào)告基因（pRL-SV40）基因質(zhì)粒，對(duì)照組采用空載體進(jìn)行代替。轉(zhuǎn)染后收集細(xì)胞，加入細(xì)胞瘤裂解液，室溫下放置30 min，吸取30 μL的裂解液加入96孔板內(nèi)，進(jìn)行EV71 3C活性檢測(cè)。反應(yīng)體系（100 μL）：熒光底物濃度分別為0、5、25、50、80、100、120 μmol/L，3C蛋白酶濃度為1 μmol/L，混勻后立即進(jìn)行動(dòng)力學(xué)檢測(cè)，得到底物濃度與熒光強(qiáng)度的關(guān)系。根據(jù)每一組反應(yīng)前10 min對(duì)應(yīng)的熒光值選取計(jì)算反應(yīng)初速度，定義酶反應(yīng)初速度為單位時(shí)間內(nèi)切割熒光底物產(chǎn)生的熒光強(qiáng)度。以底物濃度的倒數(shù)為橫坐標(biāo)，酶反應(yīng)速率的倒數(shù)為縱坐標(biāo)建立米氏方程的模擬形式。通過(guò)作散點(diǎn)圖得到仿米氏方程一般式為

y

=2.448 1

x

+0.04，R=0.925。選取熒光底物濃度為20 μmol/L，3C蛋白酶濃度為1 μmol/L進(jìn)行動(dòng)力學(xué)反應(yīng)，熒光強(qiáng)度與時(shí)間的線性關(guān)系為

y

=10.242

x

+5.030 3。

表2 EV71感染對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響/±s

2.1 引物設(shè)計(jì)結(jié)果

利用NCBI軟件，遵循引物設(shè)計(jì)原則進(jìn)行引物設(shè)計(jì)，其結(jié)果如表1所示。

但是，我這樣做就把葉靄玲逼到了一個(gè)絕殺的賽點(diǎn)上。她不得不對(duì)我發(fā)出了決裂的宣言，宣布與我徹底斷絕關(guān)系。我以為這件事到此也就解決了。可是真要與葉靄玲決裂了，倒使我考慮將來(lái)究竟怎么辦？難道我真的打算娶白麗筠為妻嗎？

表4 TAB2質(zhì)粒導(dǎo)入或者TAK1復(fù)合體質(zhì)粒導(dǎo)入對(duì)NF-kB蛋白表達(dá)的影響/±s

2.5 EV71 3C活性與NF-kB mRNA和NF-kB蛋白表達(dá)的影響

不同濃度EV71感染后細(xì)胞內(nèi)EV71 3C活性及其細(xì)胞內(nèi)NF-kB表達(dá)見(jiàn)表5、圖2和圖3。當(dāng)不同濃度的EV71感染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)EV71 3C活性出現(xiàn)明顯差異，而隨著蛋白酶活性的增加，細(xì)胞內(nèi)NF-kB mRNA的表達(dá)成明顯的下調(diào)趨勢(shì)。不同濃度EV71感染后細(xì)胞內(nèi)EV71 3C活性及其細(xì)胞內(nèi)NF-kB蛋白表達(dá)見(jiàn)表5。由表5可知，當(dāng)不同濃度的EV71感染細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)EV71 3C活性出現(xiàn)明顯差異，而隨著蛋白酶活性的增加，細(xì)胞內(nèi)NF-kB蛋白的表達(dá)成明顯下降（酶活性1 μmol/L時(shí)NF-kB蛋白/βactin為0.23±0.06）。

圖2 NF-kB的mRNA表達(dá)水平（M：GAPDH分子量146kD）

圖3 NF-kB的蛋白表達(dá)水平

表5 EV71 3C活性對(duì)NF-kB mRNA的表達(dá)/±s

表3 EV71感染對(duì)細(xì)胞內(nèi)相關(guān)因子mRNA表達(dá)的影響/±s

3 討論

EV71是腸道病毒屬中一種小RNA病毒科，其RNA主要為單股正旋，具有較強(qiáng)的耐酸和耐熱特性，決定了EV71能通過(guò)糞、口傳播和自我復(fù)制的高耐熱功能。其致病屬于是多分子、多因素、多途徑的作用過(guò)程，病毒的免疫結(jié)果和機(jī)體的抗免疫功能決定了病毒的感染結(jié)果，然而，兒童的不健全、不成熟的免疫系統(tǒng)極易使其成為感染機(jī)體。當(dāng)病兒感染EV71后癥狀較輕，但當(dāng)其成為重癥病例時(shí)，可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)和呼吸感染、循環(huán)功能障礙。星形膠質(zhì)細(xì)胞是神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的一種，具有獨(dú)立的結(jié)構(gòu)域，和神經(jīng)元之間具有明顯、廣泛的形態(tài)學(xué)交互作用，其主要功能是攝取和清除突觸前由神經(jīng)元釋放的神經(jīng)遞質(zhì)如γ-氨基丁酸（GABA）、谷氨酸等用于再循環(huán)。同時(shí)，星形膠質(zhì)細(xì)胞通過(guò)清理存在的神經(jīng)遞質(zhì)達(dá)到預(yù)防由谷氨酸誘導(dǎo)產(chǎn)生的神經(jīng)毒性，并能通過(guò)攝取金屬離子來(lái)維持神經(jīng)元內(nèi)的電化學(xué)平衡。報(bào)道稱，星形膠質(zhì)細(xì)胞在一定條件下可釋放信號(hào)傳導(dǎo)分子如膠質(zhì)遞質(zhì)。近年來(lái)，EV71多次流行，基因也在不斷的進(jìn)化，致使兒童致殘、致死的病例不斷出現(xiàn)。

SOP批準(zhǔn)后，組織相關(guān)科室人員培訓(xùn)、考核并全院實(shí)施。護(hù)理部負(fù)責(zé)對(duì)執(zhí)行情況進(jìn)行檢查，對(duì)存在的問(wèn)題及時(shí)整理。每季度組織1次SOP質(zhì)量改進(jìn)會(huì)議，總結(jié)實(shí)際應(yīng)用中存在的優(yōu)缺點(diǎn)并及時(shí)反饋給SOP小組，由SOP小組對(duì)其進(jìn)行修訂。SOP確定后，每年進(jìn)行1次常規(guī)的全面審核與修訂，當(dāng)技術(shù)規(guī)范有新進(jìn)展或使用過(guò)程中發(fā)現(xiàn)有需要修訂的內(nèi)容時(shí)，及時(shí)修訂。

EV71 3C可通過(guò)將宿主炎性因子水解或抑制其表達(dá)，達(dá)到DNA修復(fù)功能和宿主細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)的合成系統(tǒng)被關(guān)閉，進(jìn)而降低了天然免疫系統(tǒng)對(duì)宿主細(xì)胞的攻擊。當(dāng)其活性位點(diǎn)發(fā)生改變，會(huì)造成病毒包裝的失敗。細(xì)胞因子具有多種特定的生物學(xué)作用，如調(diào)節(jié)和介導(dǎo)炎癥反應(yīng)和免疫應(yīng)答，參與炎癥發(fā)生的病理?yè)p害等。本研究發(fā)現(xiàn)EV71感染可誘導(dǎo)TAK1和其復(fù)合體蛋白TAB123的降解，并呈現(xiàn)時(shí)間依賴性，但對(duì)于TRAF2和TBK1表達(dá)無(wú)影響。同時(shí)，細(xì)胞內(nèi)IL6、IL8、IL12及IL1β的表達(dá)均在24h后顯著提高；TAB2可誘導(dǎo)NF-kB激活，而與3C蛋白共同表達(dá)時(shí)可顯著抑制NF-kB表達(dá)，3C蛋白亦可顯著抑制由TAK1復(fù)合體作用誘導(dǎo)NF-kB的激活。不同濃度EV71感染后，細(xì)胞內(nèi)EV71 3C活性出現(xiàn)明顯差異，而隨著蛋白酶活性的增加，細(xì)胞內(nèi)NF-kB mRNA和蛋白的表達(dá)均成明顯的下調(diào)趨勢(shì)。EV71 3C功能與RNA結(jié)合功能在宿主和病毒的相互作用及病毒復(fù)制中具有重要影響，3C蛋白的酶活性中心在病毒的生命周期和復(fù)制過(guò)程中均發(fā)揮著重要作用。本研究表明，當(dāng)3C蛋白酶的活性位點(diǎn)發(fā)生突變后，則病毒就不能成功的復(fù)制出來(lái)，因此可作為眾多抗病毒藥物的重要篩選途徑。EV71 3C能在抑制模式下識(shí)別RIG-I受體及其下游MAVS效應(yīng)分子結(jié)合，抑制IFNβ產(chǎn)生。同時(shí)，EV71 3C可通過(guò)切割TLR3信號(hào)通路中的TRIF關(guān)鍵蛋白損壞TLR3介導(dǎo)作用，抑制NF-kB激活和IRF3磷酸化。本研究推測(cè)，3C亦可通過(guò)作用與NF-kB上游分子TAK1，達(dá)到阻礙NF-kB信號(hào)通路。

病毒可通過(guò)多種途徑調(diào)節(jié)TAK1復(fù)合體，達(dá)到調(diào)控NF-kB通路的目的，最終用于調(diào)控細(xì)胞因子和轉(zhuǎn)錄的產(chǎn)生。其中TAK1是調(diào)控NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)過(guò)程的關(guān)鍵因子。當(dāng)TAK1受到異常刺激后，即可發(fā)生泛素化和磷酸化，與TAB1/2/3之間形成復(fù)合體，用于下游信號(hào)通路的調(diào)節(jié)，激活MF-kB、JNK、ERK和P38信號(hào)通路。許多病毒可通過(guò)調(diào)節(jié)TAKI信號(hào)通路來(lái)調(diào)控NF-kB通路。HTLV的Tax蛋白在受到外界刺激時(shí)，細(xì)胞內(nèi)的信號(hào)通路便會(huì)激活，Tax與RelA、TAB2之間形成復(fù)合物，促使NF-kB的活化。

綜上所述，腸道病毒71型感染的星形膠質(zhì)細(xì)胞中EV71 3C可通過(guò)調(diào)節(jié)TAK1蛋白表達(dá)，達(dá)到抑制NF-κB信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)的作用。