微小RNA-520g、微小RNA-532在80例多發(fā)性骨髓瘤骨髓組織中的表達(dá)

郭亮，李真真，王一平，寇儒

多發(fā)性骨髓瘤是一種漿細(xì)胞惡性腫瘤，在骨髓中積聚，導(dǎo)致骨髓破壞和骨髓衰竭，它是僅次于非霍奇金淋巴腫瘤的血液惡性腫瘤。在美國(guó)和歐洲，多發(fā)性骨髓瘤的年發(fā)病率為40%～60%，在中國(guó)為10%～25%，好發(fā)于老年人，其主要臨床表現(xiàn)貧血、出血、骨痛或骨折、高鈣癥、腎功能不全及免疫功能低下等。國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)骨髓瘤的治療及研究多集中于細(xì)胞遺傳學(xué)、分子生物學(xué)及骨髓微環(huán)境上，而近期對(duì)于非編碼蛋白基因的研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs（微小RNA）分子組成的網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)也參與了骨髓瘤細(xì)胞的生長(zhǎng)和生存。miRNAs是一類小分子的非編碼單鏈RNA的基因產(chǎn)物，長(zhǎng)度約為20～25個(gè)核苷酸，能夠在轉(zhuǎn)錄后對(duì)靶基因表達(dá)水平進(jìn)行調(diào)控。目前已經(jīng)證實(shí)，miRNA與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，是一類潛在的促癌或抑癌基因。miR-520g（微小RNA-520g）屬于miR-515（微小RNA-515）家族成員，表達(dá)于胎盤細(xì)胞及某些腫瘤組織中。近年研究發(fā)現(xiàn)，miR-520g是糖酵解調(diào)控的中間調(diào)控因子，與肝癌病人的整體生存率相關(guān)。miR-532（微小RNA-532）已被證實(shí)與多種腫瘤相關(guān)。Zhang等發(fā)現(xiàn)miR-532-5p（微小RNA-532-5p）在胃癌細(xì)胞中低表達(dá)，且miR-532-5p的低表達(dá)與胃癌病人的不良預(yù)后相關(guān)。miR-520g、miR-532在不同腫瘤中有特異性表達(dá)，但在多發(fā)性骨髓瘤中的研究較少，本研究探討了二者在多發(fā)性骨髓瘤中的表達(dá)水平及臨床意義。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2015年7月至2019年7月西安市中心醫(yī)院收治的多發(fā)性骨髓瘤病人80例為觀察組，年齡（58.8±7.3）歲，其中男性46例，女性34例。同時(shí)選取同期進(jìn)行髂骨穿刺并明確骨髓功能無(wú)異常的非血液病病人80例為對(duì)照組，年齡（57.2±8.9）歲；其中男性43例，女性37例。兩組年齡、性別差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

t

=1.243，

P

=0.216；

χ

=0.228，

P

=0.633）。納入標(biāo)準(zhǔn)：①觀察組骨髓組織按照世界衛(wèi)生組織（WHO）多發(fā)性骨髓瘤標(biāo)準(zhǔn)診斷；②既往無(wú)血液系統(tǒng)疾病史；③臨床病理資料完整，病人及其近親屬均知情同意，本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會(huì)赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：①合并急性感染性疾病；②合并其它器官的惡性腫瘤；③妊娠期或哺乳期婦女。

根據(jù)國(guó)際分期系統(tǒng)（international staging system，ISS）進(jìn)行分期：其中Ⅰ期病人36例，Ⅱ期病人28例，Ⅲ期病人16例。根據(jù)骨髓漿細(xì)胞比例進(jìn)行分組：骨髓漿細(xì)胞＜10%有13例為低度分化；10%～30%有30例 為 中 度 分 化；≥30%有37例 為 高 度分化。

1.2 主要試劑及儀器

Trizol RNA提取試劑盒（上海閃晶分子生物科技有限公司，貨號(hào)ZN00801），反轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京紐樸生物技術(shù)有限公司，貨號(hào)205311），miR-520g、miR-532檢測(cè)試劑盒（賽默飛世爾科技有限公司）；ABI StepOnePlus實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（北京安麥格貿(mào)易有限公司）、臺(tái)式超速離心機(jī)（上海培清科技股份有限公司，PQ-1600A）。

1.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qRT-PCR）法檢測(cè)骨髓組織中miR-520g、miR-532表達(dá)水平

留取兩組受試者髂骨穿刺時(shí)的骨髓標(biāo)本組織，采用qRTPCR法測(cè)定其中miR-520g、miR-532表達(dá)量。采用Trizol法提取骨髓組織中總RNA并溶于20 μLDEPC水中，操作步驟按照Trizol試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行，應(yīng)用反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，反應(yīng)體系：逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物10 μL，25 mmol MgCl（氯化鎂）4 μL，10×PCR反應(yīng)緩沖液8 μL，TaqDNA酶1 μL，引物20 pmol/L，補(bǔ)充DEPC處理過(guò)的水至終體積100 μL。反應(yīng)條件：95℃、1 min，95℃、15 s，60℃、1 min，72℃、10 s，共40個(gè)循環(huán)。miR-520g、miR-532均以U6作為內(nèi)參，引物序列見(jiàn)表1。采用Folds=2計(jì)算基因的相對(duì)表達(dá)量。

表1 引物序列表

2 結(jié)果

2.1 兩組骨髓組織中miR-520g、miR-532表達(dá)水平

如表2所示，與對(duì)照組相比，觀察組病人骨髓組織中miR-520 g表達(dá)水平升高，miR-532表達(dá)水平降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05）。

表2 兩組骨髓組織中miR-520g、miR-532表達(dá)水平比較/±s

2.2 miR-520g、miR-532表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤臨床病理特征的相關(guān)性

以多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g水平平均數(shù)（3.70±0.70）分為miR-520g高表達(dá)組39例，低表達(dá)組41例；以多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-532（0.90±0.24）表達(dá)水平平均數(shù)分為miR-532高表達(dá)組42例，低表達(dá)組38例。多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g、miR-532與病人年齡、性別、一般分型無(wú)關(guān)（

P

＞0.05），與臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（

P

＜0.05）。詳見(jiàn)表3。

表3 多發(fā)性骨髓瘤臨床病理特征與miR-520g、miR-532表達(dá)水平的相關(guān)性/例

2.3多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g與miR-532表達(dá)的相關(guān)性

Pearson分析結(jié)果顯示，多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g與miR-532表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（

r

=-0.426，

P

＜0.001），見(jiàn)圖1。

圖1 多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g與miR-532表達(dá)水平相關(guān)性

2.4 miR-520g與miR-532對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值

ROC曲線結(jié)果顯示，骨髓組織中miR-520g表達(dá)水平診斷多發(fā)性骨髓瘤的曲線下面積（AUC）為0.827，敏感度為73.8%，特異性為80.0%，95%

CI

為0.764～0.889；骨髓組織中miR-532表達(dá)水平診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC為0.855，敏感度為82.5%，特異性為75.0%，95%CI為0.797～0.912。二者聯(lián)合診斷多發(fā)性骨髓瘤的AUC達(dá)到0.922，敏感度為81.3%，特異性為91.2%。詳見(jiàn)表4、圖2。

表4 骨髓組織中miR-520g與miR-532表達(dá)水平對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值分析

圖2 miR-520g與miR-532對(duì)多發(fā)性骨髓瘤的診斷價(jià)值

3 討論

多發(fā)性骨髓瘤源于免疫系統(tǒng)淋巴細(xì)胞，是一種發(fā)病率較高的血液系統(tǒng)惡性腫瘤，占所有腫瘤發(fā)生率的1%，預(yù)后較差。流行病學(xué)調(diào)查顯示，近年來(lái)多發(fā)性骨髓瘤發(fā)病率逐年上升，每年約有52 000人死于多發(fā)性骨髓瘤，目前對(duì)于多發(fā)性骨髓瘤的病因及發(fā)病機(jī)制尚無(wú)統(tǒng)一學(xué)說(shuō)，已有認(rèn)識(shí)包括兩方面：遺傳學(xué)改變和細(xì)胞因子作用。miRNA的發(fā)現(xiàn)為進(jìn)一步研究提供了新方向。近年來(lái)，隨著miRNA的研究不斷深入，許多學(xué)者對(duì)其研究取得了突破性進(jìn)展。研究表明，miRNAs表達(dá)水平的變化與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。miRNAs可能參與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生過(guò)程，并在多發(fā)性骨髓瘤中發(fā)揮致癌或抑癌作用。例如，嚴(yán)笑等研究表明，miRNA-181a（微小RNA-181a）在多發(fā)性骨髓瘤中高表達(dá)，沉默miRNA-181a的表達(dá)能夠抑制多發(fā)性骨髓瘤RPM18226細(xì)胞的增殖，并降低細(xì)胞的遷移能力。

miR-520g是miR-515家族成員之一，在胎盤細(xì)胞及腫瘤組織中廣泛表達(dá)。miR-520g能通過(guò)基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）參與子宮內(nèi)膜異位癥的發(fā)生。有研究表明，miR-520g可能通過(guò)抑制Smad7蛋白的表達(dá)促進(jìn)肝癌細(xì)胞遷移及上皮細(xì)胞間質(zhì)轉(zhuǎn)型。也有研究證實(shí)，miR-520基因在腦腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，生長(zhǎng)在腫瘤球體內(nèi)的細(xì)胞內(nèi)源性表達(dá)miR-520g會(huì)導(dǎo)致組織凝血活酶下調(diào)，提示miR-520g可以通過(guò)控制血管生成來(lái)實(shí)現(xiàn)對(duì)腫瘤血管微環(huán)境的調(diào)控，并與凝血調(diào)節(jié)之間存在關(guān)聯(lián)。miR-520g在腫瘤中的研究較多，但在血液系統(tǒng)腫瘤中研究較少。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，miR-520g在多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中呈高表達(dá)，提示miR-520g與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生有關(guān)。且miR-520g表達(dá)與多發(fā)性骨髓瘤的臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與病人的年齡、性別、一般分型無(wú)關(guān)，提示miR-520g可能參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)展。另ROC結(jié)果顯示，miR-520g診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC曲線下面積為0.827，敏感度為73.8%，特異性為80.0%，95%

CI

為0.764～0.889，說(shuō)明miR-520g能夠較好的區(qū)分多發(fā)性骨髓瘤病人與正常受試者。miR-532位于人染色體XP11.23，它的序列在哺乳動(dòng)物中是高度保守的，位于micro-188上游的400 nt單位。研究表明，miR-532在大腸癌組織和細(xì)胞系中顯著下調(diào)，通過(guò)直接靶向胰島素樣生長(zhǎng)因子1受體和調(diào)控PI3K/Akt信號(hào)通路在大腸癌的發(fā)生中起重要作用。有研究表明，在慢性淋巴細(xì)胞白血病中，miR-532表達(dá)上調(diào)。近年來(lái)對(duì)miR-532的研究表明其在不同的腫瘤組織中有不同的表達(dá)，在血液系統(tǒng)惡性腫瘤中的研究較少，與多發(fā)性骨髓瘤的關(guān)系不明確。本研究結(jié)果顯示，與對(duì)照組相比，多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-532呈低表達(dá)，提示miR-532表達(dá)水平與多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生存在聯(lián)系。多發(fā)性骨髓瘤病人臨床病理指標(biāo)與miR-532的相關(guān)性分析結(jié)果顯示，miR-532表達(dá)與病人的年齡、性別及多發(fā)性骨髓瘤的一般分型無(wú)關(guān)，與多發(fā)性骨髓瘤的臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)。提示miR-532可能參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)病、發(fā)展。本研究Pearson分析結(jié)果顯示，miR-520g與miR-532表達(dá)呈負(fù)相關(guān)（

P

＜0.05），提示miR-520g與miR-532可能以某種機(jī)制參與了多發(fā)性骨髓瘤的發(fā)生，其具體互作機(jī)制有待進(jìn)一步研究。另ROC結(jié)果顯示，miR-532診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC曲線下面積為0.855，敏感度為82.5%，特異性為75.0%，95%

CI

為0.797～0.912，miR-520g與miR-532聯(lián)合診斷多發(fā)性骨髓瘤的ROC的曲線下面積為0.922，敏感度為81.3%，特異性為91.2%，二者聯(lián)合診斷多發(fā)性骨髓瘤能達(dá)到較好效果，提示miR-520g與miR-532聯(lián)合檢測(cè)可作為診斷多發(fā)性骨髓瘤的潛在生物學(xué)指標(biāo)。

綜上所述，多發(fā)性骨髓瘤病人骨髓組織中miR-520g呈高表達(dá)，miR-532呈低表達(dá)，二者呈負(fù)相關(guān)，且均與臨床分期、分化程度、是否發(fā)生淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等臨床病理特征相關(guān)，兩者聯(lián)合檢測(cè)對(duì)多發(fā)性骨髓瘤具有一定診斷價(jià)值。