微小RNA-202和轉(zhuǎn)錄因子性別決定區(qū)Y框蛋白9在膀胱癌組織中表達(dá)與臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系

李路鵬，李曉光，劉棚越，劉敬濤，焦志靈，徐國良，王連渠

膀胱癌是臨床最常見泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤疾病之一，存在性別差異，男性發(fā)病率高于女性。全球范圍內(nèi)，膀胱癌發(fā)病率位于惡性腫瘤第11位，死亡率位于第14位，在國內(nèi)其發(fā)病率居惡性腫瘤第8位，居泌尿生殖系統(tǒng)惡性腫瘤第1位，并以每年3.9%增長率升高，且趨于年輕化，嚴(yán)重威脅病人生命健康。微小RNA（miRNA）在多種疾病中異常表達(dá)，參與疾病的發(fā)生、發(fā)展，微小RNA-202（miR-202）在多種惡性腫瘤疾病中低表達(dá)，而在膀胱癌組織中表達(dá)情況研究報道較少。轉(zhuǎn)錄因子性別決定區(qū)Y框蛋白9（Sox9）在胚胎期參與胃、腸、膽管等多種器官定向分化過程，進(jìn)年來研究發(fā)現(xiàn)Sox9在多種惡性腫瘤中過表達(dá)，在腫瘤發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。因此，本研究旨在探討miR-202和Sox9在膀胱癌中的表達(dá)及與臨床預(yù)后的關(guān)系，為膀胱癌預(yù)防、治療及預(yù)后評估提供參考資料。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2012年6月至2013年12月河南大學(xué)第一附屬醫(yī)院腫瘤科收治的120例行切除術(shù)的膀胱癌病人作為研究對象，其中膀胱全切除21例，膀胱部分切除術(shù)48例，經(jīng)尿道膀胱腫瘤電切除51例，淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者行淋巴結(jié)清掃，術(shù)中分別收集病人癌組織（

n

=120）及癌旁正常組織（

n

=120）。納入標(biāo)準(zhǔn)：（1）經(jīng)組織病理學(xué)確診為膀胱癌者；（2）治療前無手術(shù)、放化療史者；（3）病人對本研究知情，并簽署知情同意書；（4）本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。排除標(biāo)準(zhǔn)：（1）膀胱癌復(fù)發(fā)病人；（2）非本院手術(shù)者；（3）預(yù)測生存期＜3個月者；（4）原位癌者；（5）合并嚴(yán)重慢性病及實質(zhì)器官功能障礙者；（6）血小板凝集障礙者；（7）自身免疫功能異常者；（8）合并其他器官惡性腫瘤者；（9）依從性差者。病人男82例，女38例；年齡范圍41～78歲，年齡（58.73±4.28）歲；病理類型：膀胱尿路上皮癌109例，膀胱腺癌7例，膀胱鱗狀細(xì)胞癌5例；腫瘤臨床分期采用國際抗癌聯(lián)盟（UICC）（2002）腫瘤-轉(zhuǎn)移-淋巴結(jié)分類（TNM）分期系統(tǒng)，其中肌層浸潤病人（Ta期27例，Tb期30例，Ta期17例，Tb期4例）78例，非肌層浸潤者（T期15例，T期27例）42例；病理分級按照WHO（2004年）分級標(biāo)準(zhǔn)：低級（G1+G2）54例，高級（G3）66例；影像學(xué)與病理學(xué)診斷為淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者21例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移者99例。

1.2 試劑與儀器

兔抗人Sox9抗體購自英國abcam公司，SP法蛋白提取試劑盒購自上?？党缮锕こ坦?，Trizol購自Invitrogen公司，PrimeScriptRT reagent Kit、SYBR ?Premix Ex TaqⅡ購自大連Takara公司，Nanodrop 2000核酸檢測儀購自美國Themo公司，C1000Thermal CyclerPCR儀、Gel Doc XR+凝膠成像系統(tǒng)均購自美國bio-rad公司，7500Fast Real-time PCR儀購自美國ABI公司，引物序列由上海生工公司合成。

1.3 方法

采用免疫組化（SP法）檢測病人組織中Sox9表達(dá)，以PBS作為陰性對照，待測組織4%多聚甲醛固定，包埋，切片，脫蠟、水化，抗原修復(fù)，操作步驟按照SP試劑盒說明書執(zhí)行，Sox9染色定位于細(xì)胞核；采用熒光定量PCR（qRT-PCR）檢測組織中miR-202、Sox9水平，首先根據(jù)試劑使用說明，取待測組織加液氮研磨成粉末狀，置于離心管中，加Trizol 1 mL，提取總RNA，核酸檢測儀檢測RNA濃度和純度，符合要求方可進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄；cDNA合成：參照SYBR Green RCR master mix試劑（寶生物（大連）工程有限公司生產(chǎn)）說明加配熒光定量反應(yīng)體系。引物由北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列見表1。熒光定量反應(yīng)體系加配完成后，放入Bio-Rad熒光定量PCR儀進(jìn)行反應(yīng)，反應(yīng)結(jié)束后收集數(shù)據(jù)。miR-202以U6為內(nèi)參基因，Sox9以β-actin為內(nèi)參基因，采用2方法計算miR-202、Sox9相對表達(dá)量，引物序列見表1。

表1 qRT-PCR擴(kuò)增引物序列

2 結(jié)果

2.1 膀胱癌組織及癌旁組織中Sox9蛋白表達(dá)

膀胱癌組織中Sox9陽性表達(dá)率為70.83%（85/120），高于癌旁組織的31.67%（38/120）（

P

＜0.05），見圖1。

圖1 膀胱癌組織及癌旁組織中Sox9蛋白表達(dá)（SP×200）：A為膀胱癌組織中Sox9蛋白表達(dá)；B為癌旁組織中Sox9蛋白表達(dá)

2.2 膀胱癌組織及癌旁組織中miR-202和Sox9表達(dá)

膀胱癌組織中miR-202水平低于癌旁組織（

P

＜0.05），Sox9水平高于癌旁組織（

P

＜0.05），見表2。

表2 膀胱癌組織及癌旁組織中miR-202和Sox9表達(dá)比較

2.3 miR-202和Sox9表達(dá)與病人臨床病理參數(shù)關(guān)系

以膀胱癌病人組織中miR-202和Sox9表達(dá)中位數(shù)（0.63、7.92）為界值分為miR-202高表達(dá)組（

n

=68）和低表達(dá)組（

n

=52），Sox9高表達(dá)組（

n

=55）和低表達(dá)組（

n

=65）。miR-202、Sox9表達(dá)與年齡、性別、肌層浸潤無關(guān)（

P

＞0.05），與病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)（

P

＜0.05），見表3。

表3 膀胱癌120例miR-202和Sox9表達(dá)與臨床病理參數(shù)關(guān)系/例

2.4 膀胱癌組織中miR-202和Sox9表達(dá)相關(guān)性

Pearson相關(guān)性分析顯示，膀胱癌組織中miR-202和Sox9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)性（

r

=-0.835，

P

＜0.001），見圖2。

圖2 膀胱癌120例癌組織中miR-202和Sox9表達(dá)相關(guān)性

2.5 miR-202、Sox9表達(dá)與膀胱癌病人預(yù)后關(guān)系

術(shù)后隨訪5年，膀胱癌組織中miR-202高表達(dá)病人中位生存時間為48.61個月，高于低表達(dá)組的37.99個月（

P

＜0.05），miR-202高表達(dá)病人預(yù)后5年生存率為52.94%，高于低表達(dá)的30.77%（

P

＜0.05），見圖3；Sox9高表達(dá)病人中位生存時間為（39.78±2.60）個月，低于低表達(dá)組的（49.62±1.90）個月（

P

＜0.05），Sox9高表達(dá)病人預(yù)后5年生存率為38.18%，低于低表達(dá)組的60.00%（

P

＜0.05），見圖4。

圖3 膀胱癌120例癌組織中miR-202高表達(dá)與低表達(dá)生存曲線分析

圖4 膀胱癌120例癌組織中Sox9高表達(dá)與低表達(dá)生存曲線分析

2.6 膀胱癌預(yù)后影響因素分析

先對病人年齡、性別、腫瘤數(shù)目、病理分級、TNM分期、淋巴結(jié)是否轉(zhuǎn)移、miR-202、Sox9表達(dá)進(jìn)行COX單因素回歸分析，采用LR法進(jìn)行回歸變量篩選，再對有統(tǒng)計學(xué)差異的變量進(jìn)行COX多因素回歸分析，結(jié)果顯示，病理分級與膀胱癌病人預(yù)后無影響，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Sox9是影響病人預(yù)后的獨立危險因素，miR-202是影響膀胱癌病人預(yù)后的保護(hù)因素，見表4。

表4 膀胱癌120例影響預(yù)后的COX多因素回歸分析

3 討論

miRNA是一類高保守非編碼單鏈小RNA，廣泛存在于各種生物體中，發(fā)揮基因調(diào)控功能。近年來，越來越多研究發(fā)現(xiàn)miRNA在膀胱癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。陳玉錦等研究發(fā)現(xiàn)miR-20a在膀胱癌組織中高表達(dá)，與腫瘤臨床分期、病理分級、轉(zhuǎn)移及復(fù)發(fā)相關(guān)，體外轉(zhuǎn)染其模擬物能提高腫瘤細(xì)胞增殖、侵襲及遷移能力。Ganji等發(fā)現(xiàn)miR-99a在膀胱癌組織中表達(dá)水平低于癌旁正常組織，并與肌層浸潤相關(guān)，檢測靈敏度為91%，特異性為97%，可作為膀胱癌診斷標(biāo)記物。miR-202屬于miRNA，在多種腫瘤疾病中異常表達(dá)，於琳等發(fā)現(xiàn)miR-202在原發(fā)性肝癌組織及血清中均低表達(dá)，發(fā)揮抑癌基因作用，并與腫瘤數(shù)目相關(guān)，并能影響腫瘤細(xì)胞增殖，在原發(fā)性肝癌發(fā)生、發(fā)展中發(fā)揮重要作用。Zhang等研究發(fā)現(xiàn)miR-202在前列腺癌組織及細(xì)胞系中表達(dá)下調(diào)，其高表達(dá)可抑制腫瘤增殖、遷移及侵襲，并能通過調(diào)控其靶基因PIK3CA發(fā)揮腫瘤抑制劑作用。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中miR-202水平低于癌旁正常組織，與上述研究結(jié)果基本相似，提示miR-202在膀胱癌組織中低表達(dá)。通過與臨床病理參數(shù)關(guān)系研究顯示，miR-202表達(dá)與病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，與Zhang等研究結(jié)果基本相似，提示miR-202參與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展。研究中發(fā)現(xiàn)miR-202表達(dá)與臨床分期無關(guān)，可能于本研究樣本量少有關(guān)。

Sox是一類與胚胎發(fā)育密切相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子，Sox9是Sox家族重要成員之一，在多種腫瘤組織中高表達(dá)，尤其在惡性腫瘤中多發(fā)揮促癌基因作用。Link等研究發(fā)現(xiàn)Sox9在胃癌組織中過表達(dá)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的囊外生長相關(guān)，Sox9高表達(dá)促進(jìn)腫瘤發(fā)展，并與病人預(yù)后不良相關(guān)。Francis等研究發(fā)現(xiàn)Sox9在前列腺癌組織中高表達(dá)，與腫瘤細(xì)胞侵襲、轉(zhuǎn)移相關(guān)，體外細(xì)胞實驗發(fā)現(xiàn)Sox9可改變細(xì)胞骨架及細(xì)胞間粘附性，增強(qiáng)腫瘤細(xì)胞侵襲能力，為促進(jìn)前列腺癌進(jìn)展的驅(qū)動因素。本研究結(jié)果顯示，膀胱癌組織中Sox9陽性表達(dá)率為70.83%，高于癌旁組織的31.67%，膀胱癌組織中Sox9水平高于癌旁正常組織，并與病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，這與萬頌等研究結(jié)果基本相似，提示Sox9在膀胱癌組織中高表達(dá)，并與疾病發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。

Wainwright等研究發(fā)現(xiàn)在Sox9基因缺失小鼠模型中微小RNA-202-5p/3p（miR-202-5p/3p）在男性性腺中表達(dá)降低，miR-202前體為Sox9的下游靶基因，而Sox9與類固醇生成因子-1（SF1）結(jié)合位點突變可減少miR-202前體啟動子離體反式激活，進(jìn)一步證明miR-202前體是Sox9在睪丸分化期的直接轉(zhuǎn)錄靶點。

本研究通過相關(guān)性分析顯示，膀胱癌組織中miR-202和Sox9表達(dá)呈負(fù)相關(guān)，與上述研究結(jié)果具有相似性，提示miR-202和Sox9可能通過負(fù)向調(diào)控參與膀胱癌發(fā)生、發(fā)展，其具體機(jī)制還需進(jìn)一步研究。通過miR-202和Sox9對膀胱癌病人預(yù)后相關(guān)分析顯示，膀胱癌組織中miR-202高表達(dá)病人中位生存時間高于低表達(dá)組，miR-202高表達(dá)病人預(yù)后5年生存率為52.94%，高于低表達(dá)的30.77%；Sox9高表達(dá)病人中位生存時間低于低表達(dá)組，Sox9高表達(dá)病人預(yù)后5年生存率為38.18%，低于低表達(dá)的60.00%，與Wan等研究結(jié)果基本相似，提示miR-202低表達(dá)、Sox9高表達(dá)膀胱癌病人生存時間短，預(yù)后較差，有可能成為其預(yù)后評估的潛在生物標(biāo)記物。最后通過預(yù)后影響因素分析顯示，TNM分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、Sox9是影響病人預(yù)后的獨立危險因素，miR-202是影響膀胱癌病人預(yù)后的保護(hù)因素，進(jìn)一步提示miR-202、Sox9表達(dá)與膀胱癌預(yù)后相關(guān)。

綜上所述，膀胱癌組織中miR-202低表達(dá)，Sox9過表達(dá)，二者表達(dá)呈正相關(guān)，與病人病理分級及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移相關(guān)，miR-202低表達(dá)與Sox9高表達(dá)病人生存期短，預(yù)后較差，可作為病人預(yù)后評估的檢測指標(biāo)。由于本研究樣本量有限，且為單中心選樣，可能會造成一定結(jié)果誤差，在后期研究中盡可能擴(kuò)展樣本量，開展多中心研究，減少誤差，提高研究的準(zhǔn)確性。