微小RNA-494-3p靶向配子生成素結(jié)合蛋白2促進(jìn)結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化的實驗研究

劉敏，吳運

配子生成素結(jié)合蛋白2（GGNBP2）也被稱為ZFP403，在乳腺癌（包括三陰性乳腺癌）、膠質(zhì)瘤組織及卵巢癌組織和細(xì)胞中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)GGNBP2可抑制癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。微小RNA-494-3p（miR-494-3p）在肝細(xì)胞癌（HCC）組織表達(dá)上調(diào)并與HCC病人的預(yù)后不良和癌細(xì)胞轉(zhuǎn)移有關(guān)。miR-494-3p在人腦膠質(zhì)瘤組織和鼻咽癌中表達(dá)上調(diào)，抑制miR-494-3p可抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲、增殖并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，抑制鼻咽癌細(xì)胞的遷移和侵襲。然而miR-494-3p和GGNBP2對結(jié)直腸癌發(fā)生發(fā)展的影響尚未可知。本研究于2019年1月至2019年12月以人結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460為對照，首先檢測了結(jié)直腸癌細(xì)胞系T84、LS1034、HCT116中miR-494-3p和GGNBP2表達(dá)；然后以LS1034為研究對象，探討miR-494-3p能否靶向GGNBP2影響結(jié)直癌細(xì)胞侵襲、遷移及上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT），以期為結(jié)直腸癌的治療提供新的分子靶標(biāo)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

人結(jié)直腸癌細(xì)胞株T84、LS1034、HCT116和人結(jié)腸上皮細(xì)胞株NCM460購自美國ATCC；胎牛血清（FBS）、DMEM/F-12培養(yǎng)基和RPMI-1640培養(yǎng)基購自美國Gibco公司，牛血清白蛋白（BSA）、四基噻唑基四唑（MTT）、二甲基亞砜（DMSO）和胰蛋白酶購自美國Sigma-Aldrich公司；Transwell板購自美國Corning公司；miR-494-3p模擬物（mimics）和抑制劑（anit-miR-494-3p）、GGNBP2小干擾RNA（si-GGNBP2）和過表達(dá)載體（pcDNA-GGNBP2）、模擬對照序列（miR-con）、抑制劑陰性對照序列（anti-miR-con）、小干擾RNA陰性對照（si-con）、空載體（pcDNA-con）、GGNBP2野生型（WT-GGNBP2）和突變型（MUT-GGNBP2）熒光素酶報告載體購自上海吉瑪制藥有限公司；GGNBP2、細(xì)胞周期蛋白D1（Cyclin D1）、基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）、E-鈣黏蛋白（E-cadherin）、波形蛋白（Vimentin）、磷酸化蛋白酪氨酸激酶2（pJak2）、磷酸化信號轉(zhuǎn)導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄活化因子3（p-STAT3）及β-肌動蛋白（β-actin）抗體購自英國Abcam公司；熒光素酶活性檢測試劑盒購自美國Promega公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑、RNA提取試劑TRIzol、real-time PCR試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒購自美國Invitrogen公司；二喹啉甲酸蛋白（BCA）定量試劑盒購自江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；顯微鏡、全自動酶標(biāo)儀、發(fā)光儀及Real-time PCR儀購自美國Bio-Rad公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和處理細(xì)胞培養(yǎng)：將人正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460、人結(jié)直腸癌細(xì)胞LS1034和HCT116培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI1640培養(yǎng)基中，人結(jié)直腸癌T84細(xì)胞培養(yǎng)于含5%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)基中，培養(yǎng)液均添加100 U/L青霉素和100 mg/L鏈霉素，將細(xì)胞置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。細(xì)胞生長密度值90%時，消化傳代。

1.2.2 Real-time PCR檢測RNA的表達(dá)將對數(shù)期各細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×l0個/毫升，接種于6孔板中（每孔2.5 mL）。培養(yǎng)48 h后，棄培養(yǎng)基，用TRIzol試劑提取細(xì)胞中總RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板行PCR反應(yīng)。反應(yīng)程序為：95℃、1 min；95℃、40 s、57℃、30 s、72℃、45 s，35個循環(huán)；72℃、10 min。運用2方法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染將對數(shù)期LS1034細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×l0個/mL，接種于6孔板中（每孔2.5mL），培養(yǎng)24h后，棄培養(yǎng)基。利用Lipofectamine 2000試劑盒，將miR-con（miR-con組）、miR-494-3p mimics（miR-494-3p組）、anti-miR-con（anti-miR-con組）、anti-miR-494-3p（anti-miR-494-3p組）、pcDNA-con（pcDNA-con組）、pcDNA-GGNBP2（pcDNA-GGNBP2組）、anti-miR-494-3p與si-con（anti-miR-494-3p+sicon組）、anti-miR-494-3p與si-GGNBP2（anti-miR-494-3p+si-GGNBP2組）共轉(zhuǎn)染至LS1034細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，換成完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，收集細(xì)胞進(jìn)行驗證，驗證成功后進(jìn)行后續(xù)實驗。

1.2.4 MTT實驗測定細(xì)胞活性將轉(zhuǎn)染后的各組LS1034細(xì)胞濃度調(diào)整至2.5×10個/毫升，接種于96孔板中（每孔200 μL）。同時設(shè)置對照（NC）組，接種未轉(zhuǎn)染的LS1034細(xì)胞。培養(yǎng)48 h時，加20 μL（5 mg/mL）MTT，孵育4 h。棄上清液，加150 μL DMSO，室溫振蕩5 min，酶標(biāo)儀測定490 nm處吸光度（A）值。細(xì)胞存活率=（A-A）/（A-A）×100%。

1.2.5 Transwell實驗測定細(xì)胞遷移和侵襲遷移實驗：將LS1034細(xì)胞用無血清RPMI1640培養(yǎng)基稀釋為1×105個/毫升，取100 μL加至Transwell小室上室，另取500 μL含10%FBS的培養(yǎng)基加至下室。培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基。用甲醛固定細(xì)胞，并用結(jié)晶紫染色后，于顯微鏡觀察并計數(shù)，每個樣本計數(shù)10個視野，取平均值。

侵襲實驗：除預(yù)先在Transwell小室上室鋪用4℃無血清培養(yǎng)基1∶8比例稀釋的Matrigel基質(zhì)膠外，剩余步驟與遷移實驗相同。

1.2.6 雙熒光素酶報告系統(tǒng)實驗將LS1034細(xì)胞以2.5×10個/孔接種于24孔板中，培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基。利用Lipofectamine 2000試劑盒，將WT-GGNBP2與miR-con或miR-494-3p mimics、MUT-GGNBP2與miR-con或miR-494-3p共 轉(zhuǎn) 染 至LS1034細(xì)胞。轉(zhuǎn)染6 h后，換為完全培養(yǎng)基。再培養(yǎng)24 h，棄培養(yǎng)基，加細(xì)胞裂解緩沖液裂解20 min。將裂解液離心（3 500 r/min、5 min），收集上清，加入熒光素酶底物，發(fā)光儀檢測上清中熒光素酶活性，結(jié)果以螢火蟲與海參的熒光強度比值表示。

1.2.7 Western blot檢測蛋白表達(dá)將細(xì)胞濃度調(diào)整為2.5×l0個/毫升，接種于6孔板中（每孔2.5 mL），細(xì)胞分組同1.2.3。培養(yǎng)48 h，棄培養(yǎng)基，加RIPA裂解液孵育20 min，超聲破碎細(xì)胞，收集蛋白，BCA法檢測蛋白濃度。取蛋白樣本進(jìn)行SDS-PAGE，轉(zhuǎn)膜，室溫封閉2 h，加入稀釋的一抗（GGNBP2抗 體1∶800、Cyclin D1抗 體1∶1 000、MMP-2抗體1∶2 000、E-cadherin抗體1∶1 500、Vimentin抗體1∶1 000和β-actin抗體1∶2 000），4℃孵育過夜。洗膜后，加稀釋的酶標(biāo)二抗，室溫孵育1 h。加化學(xué)發(fā)光試劑，避光顯影后，曝光拍照。以β-actin為內(nèi)參照，分析目的蛋白相對表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 miR-494-3p和GGNBP2在結(jié)直腸癌細(xì)胞系中的表達(dá)

與正常結(jié)直腸上皮細(xì)胞NCM460相比，結(jié)直腸癌細(xì)胞系T84、LS1034和HCT116中miR-494-3p表達(dá)量顯著升高，GGNBP2 mRNA的表達(dá)量顯著下降，GGNBP2蛋白的表達(dá)量顯著低于NCM460細(xì)胞。由于LS1034細(xì)胞中miR-494-3p和GGNBP2表達(dá)較NCM460細(xì)胞差異最顯著，因此，選擇LS1034細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實驗。見表1、圖1。

表1 結(jié)直腸癌細(xì)胞系中miR-494-3p和GGNBP2表達(dá)/±s

圖1 Western blot檢測結(jié)直腸癌細(xì)胞系中GGNBP2蛋白表達(dá)

2.2 抑制miR-

4

94-3p對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲、遷移及EMT的影響

與anti-miR-con組相比，anti-miR-494-3p組LS1034細(xì)胞中miR-494-3p表達(dá)量顯著下降，細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著下降，細(xì)胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)均下降，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin蛋白表達(dá)降低。NC組與anti-miR-con組各檢測指標(biāo)比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2，3。

表2 抑制miR-494-3p對LS1034細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響/±s

2.3 過表達(dá)GGNBP2對LS1034細(xì)胞侵襲、遷移及EMT的影響

與pcDNA-con組相比，pcDNA-GGNBP2組LS1034細(xì)胞中GGNBP2蛋白表達(dá)量顯著上升，細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著下降，細(xì)胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)均下降，E-cadherin蛋白表達(dá)升高，Vimentin蛋白表達(dá)降低。NC組與anti-miR-con組各檢測指標(biāo)比較均差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表4，5。

表4 過表達(dá)GGNBP2對LS1034細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響/±s

2.4 miR-4

9

4-3p靶向GGNBP2并抑制GGNBP2蛋白的表達(dá)

通過生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GGNBP2的3’UTR區(qū)含有與miR-494-3p互補的核苷酸序列。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，與共轉(zhuǎn)染miR-con與WT-GGNBP2的LS1034的細(xì)胞比較，共轉(zhuǎn)染miR-494-3p與WT-GGNBP2的LS1034的細(xì)胞熒光素酶活 性 顯 著 下 降［（0.37±0.08）比（1.00±0.04），

P

＜0.001］，與 共 轉(zhuǎn) 染miR-con與MUT-GGNBP2的LS1034細(xì)胞比較，與共轉(zhuǎn)染miR-494-3pWT-GGNBP2的LS1034細(xì)胞熒光素酶活性沒有明顯變化［（0.91±0.11）比（0.95±0.06），

P

=0.480］。Western blot結(jié)果發(fā)現(xiàn)，與miR-con組相比，miR-494-3p組的GGNBP2蛋 白 表 達(dá) 量 顯 著 降 低［（0.34±0.09）比（1.00±0.06），

P

＜0.001］；與anti-miR-con組相比，antimiR-494-3p組的GGNBP2蛋白表達(dá)量顯著下降［（2.04±0.14）比（0.87±0.12），

P

＜0.001］。

表3 抑制miR-494-3p對LS1034細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響/±s

2.5 沉默GGNBP2部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-494-3p對結(jié)直腸癌細(xì)胞侵襲遷移及EMT影響

與anti-miR-494-3p+si-con組 相 比，anti-miR-494-3p+si-GGNBP2組GGNBP2蛋白表達(dá)量顯著降低，細(xì)胞存活率、遷移數(shù)和侵襲數(shù)均顯著上升，細(xì)胞中Cyclin D1和MMP-2蛋白表達(dá)均升高，E-cadherin蛋白表達(dá)下降，Vimentin蛋白表達(dá)升高。見表6，7。

表5 過表達(dá)GGNBP2對LS1034細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響/±s

表6 沉默GGNBP2逆轉(zhuǎn)抑制miR-494-3p對LS1034細(xì)胞活性、遷移和侵襲的影響/±s

3 討論

結(jié)直腸癌的復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移是導(dǎo)致病人死亡的主要原因。研究表明，miRNA參與調(diào)控結(jié)直腸癌復(fù)發(fā)轉(zhuǎn)移，可作為結(jié)直腸癌治療的分子靶點。miR-494在多種癌組織中出現(xiàn)異常表達(dá)，有研究結(jié)果表明，在大多數(shù)癌癥中，miR-494的高表達(dá)可能預(yù)示著較好的總體生存率，而在結(jié)直腸癌和非小細(xì)胞肺癌中，過表達(dá)miR-494可能預(yù)示著較差的總體生存率。miR-494在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，并通過靶向PTEN基因促進(jìn)細(xì)胞遷移和侵襲。Zhang等也研究發(fā)現(xiàn)，miR-494在結(jié)直腸癌組織中表達(dá)水平顯著上調(diào)，其通過靶向腺瘤性結(jié)腸息肉病基因（APC）誘導(dǎo)Wnt/β-catenin信號通路，促進(jìn)癌細(xì)胞的生長。本研究發(fā)現(xiàn)，抑制miR-494-3p表達(dá)可以抑制LS1034細(xì)胞存活、遷移和侵襲并抑制EMT。這與Zhang等結(jié)果一致，證實miR-494-3p促進(jìn)結(jié)直腸癌的發(fā)展進(jìn)程。

表7 沉默GGNBP2部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-494-3p對LS1034細(xì)胞中Cyclin D1、MMP-2、E-cadherin和Vimentin蛋白表達(dá)的影響/±s

生物信息學(xué)預(yù)測發(fā)現(xiàn)，GGNBP2的3’UTR序列中含有與miR-494-3p互補的序列，提示GGNBP2和miR-494-3p之間可能存在調(diào)控關(guān)系，GGNBP2可能參與miR-494-3p對結(jié)直腸癌的調(diào)控過程。GGNBP2（又稱ZNF403）是一種腫瘤抑制因子，與多種癌癥的增殖、遷移和侵襲有關(guān)，支持細(xì)胞的形態(tài)和功能，在精子發(fā)生過程起關(guān)鍵作用。有報道表明，GGNBP2在卵巢癌中的下調(diào)促進(jìn)了卵巢癌的耐藥。在人細(xì)胞中敲除GGNBP2可影響細(xì)胞周期調(diào)控基因的表達(dá)譜，促進(jìn)G2/M細(xì)胞周期的阻滯，p21蛋白上調(diào)，MCM2蛋白下調(diào)；在人喉癌細(xì)胞Hep-2中敲除GGNBP2具有抗癌作用，抑制癌細(xì)胞增殖和遷移。但GGNBP2在結(jié)直腸癌中表達(dá)和作用尚不清楚。本研究 發(fā) 現(xiàn)，GGNBP2結(jié) 直 腸 癌 細(xì) 胞T84、LS1034和HCT116中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)GGNBP2可抑制LS1034細(xì)胞存活、遷移和侵襲并抑制EMT，同樣說明過表達(dá)GGNBP2具有抑癌作用。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，miR-494-3p靶向負(fù)調(diào)控GGNBP2的表達(dá)，沉默GGNBP2表達(dá)可部分逆轉(zhuǎn)抑制miR-494-3p對LS1034細(xì)胞侵襲遷移和EMT的作用，說明miR-494-3p通過調(diào)控GGNBP2促進(jìn)腫瘤發(fā)生和發(fā)展。

綜上，本研究闡述了在結(jié)直腸癌LS1034細(xì)胞中miR-494-3p通過靶向下調(diào)GGNBP2表達(dá)促進(jìn)結(jié)直腸癌LS1034細(xì)胞遷移、侵襲和EMT，miR-494-3p/GGNBP2可能為結(jié)直腸癌的治療提供了潛在分子靶點。