miR-103靶向鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白1對(duì)糖尿病腎病足細(xì)胞損傷的影響

宋現(xiàn)靜，劉明，呂文山

糖尿病腎病屬于糖尿病慢性并發(fā)癥，隨著疾病發(fā)展可引發(fā)終末期腎病。既往研究顯示免疫與炎癥反應(yīng)失衡與糖尿病腎病病人足細(xì)胞損傷密切相關(guān)。研究表明微小RNA-103（miR-103）在2型糖尿病大鼠外周血單核細(xì)胞中高表達(dá)。TargetScan預(yù)測(cè)顯示鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白R(shí)CAN 1（regulator of calcineurin 1，RCAN 1），可能是miR-103的靶基因，研究表明敲除RCAN1可加重阿霉素腎病小鼠的蛋白尿及足細(xì)胞損傷。本研究從2018年1月至2019年1月期間主要探究miR-103在高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞中的表達(dá)變化，分析干擾miR-103的表達(dá)對(duì)高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡及炎性因子分泌的影響，初步探討miR-103對(duì)RCAN1的調(diào)控作用。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

人足細(xì)胞（human podocytecell，HPC）購(gòu)自美國(guó)ATCC細(xì)胞庫(kù)。Trizol試劑、RT Reagent Kit With gDNA Eraser與SYBR Premix Ex Taq試劑均購(gòu)自日本TaKaRa公司；兔抗人RCAN1、B淋巴細(xì)胞瘤-2相關(guān)蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）、B淋巴細(xì)胞瘤-2（B-cell lymphoma-2，Bcl-2）抗體均購(gòu)自美國(guó)Abcam公司；HRP標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白（IgG）二抗購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司；白細(xì)胞介素6（interleukin-6，IL-6）、腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海江萊生物股份有限公司；miR-103特異性寡核苷酸抑制劑（anti-miR-103）及其陰性對(duì)照（anti-miR-con）、miR-103寡核苷酸模擬物（miR-103 mimics）及 陰 性 對(duì) 照mimic NC序 列（miR-con）、RCAN1小分子干擾RNA（si-RCAN1）及其陰性對(duì)照（si-con）均購(gòu)自上海吉瑪制藥技術(shù)有限公司；細(xì)胞凋亡檢測(cè)試劑盒購(gòu)自上海翊圣生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)及實(shí)驗(yàn)分組HPC細(xì)胞接種于6孔板，待HPC細(xì)胞分化成熟進(jìn)行高糖刺激，25 mmol/L高糖分別刺激6、12、24 h，檢測(cè)各組足細(xì)胞凋亡率，篩選適宜濃度進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)分組：正常糖組（NG組）、高糖（HG）6 h組、HG12 h組、HG 24 h組。干擾miR-103表達(dá)對(duì)高糖刺激人足細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌的影響。實(shí)驗(yàn)分組：HG+anti-miR-con組（足細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-con 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）、HG+anti-miR-103組（足細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-103 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）。miR-103調(diào)控RCAN1的表達(dá)，實(shí)驗(yàn)分組：miR-con組（HPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-con 24h）、miR-103組（HPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-103 mimics 24 h）、anti-miR-con組（HPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-con 24 h）、anti-miR-103組（HPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染anti-miR-103 24 h）。過(guò)表達(dá)RCAN1對(duì)高糖刺激人足細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響，實(shí)驗(yàn)分組：HG+pcDNA組（HPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA 24 h，含有25 mmol/L高糖 的 培 養(yǎng) 液 培 養(yǎng)12 h）、HG+pcDNA-RCAN1組（HPC細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA-RCAN1 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）。干擾RCAN的表達(dá)聯(lián)合干擾miR-103的表達(dá)對(duì)高糖刺激人足細(xì)胞的作用，實(shí)驗(yàn)分組：HG+anti-miR-103+si-con組（HPC細(xì)胞共轉(zhuǎn)染anti-miR-103與si-con 24 h，含有25 mM高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）、HG+anti-miR-103+si-RCAN1組（HPC細(xì)胞共轉(zhuǎn)染anti-miR-103與si-RCAN1 24 h，含有25 mmol/L高糖的培養(yǎng)液培養(yǎng)12 h）。

1.2.2 qRT-PCR檢 測(cè) 細(xì) 胞 中miR-103、RCAN1 mRNA表達(dá)水平取各組HPC細(xì)胞，提取RNA。按照反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)將總RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA。qRT-PCR反應(yīng)：以cDNA為模板，反應(yīng)條件為95℃、2 min，95℃、30 s，60℃、30 s，72℃、30 s，共循環(huán)40次。采用2法計(jì)算miR-103、RCAN1 mRNA相對(duì)表達(dá)量。

1.2.3 檢測(cè)細(xì)胞中IL-6、TNF-α含量收集各組細(xì)胞培養(yǎng)液，按照酶聯(lián)免疫吸附（ELISA）試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行操作、檢測(cè)IL-6、TNF-α含量。

1.2.4 流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)細(xì)胞凋亡收集各組HPC細(xì)胞10 000 r/min轉(zhuǎn)速離心5 min（4℃），PBS洗滌，加入1 mL結(jié)合緩沖液，相同條件下離心，棄上清，分別加入200 μL結(jié)合緩沖液，按照凋亡檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)檢測(cè)細(xì)胞凋亡率。

1.2.5 熒光素酶報(bào)告基因檢測(cè)野生型載體WTRCAN1與突變型載體MUT-RCAN1，取HPC細(xì)胞，將WT-RCAN1、MUT-RCAN1分別與miR-103 mimics、miR-con共轉(zhuǎn)染至HPC細(xì)胞，37℃恒溫培養(yǎng)箱內(nèi)繼續(xù)培養(yǎng)48 h，收集細(xì)胞，按照熒光素酶活性檢測(cè)試劑盒檢測(cè)各組熒光素酶活性。

1.2.6 Western blotting檢測(cè)RCAN1、Bax、Bcl-2蛋白表達(dá)取各組HPC細(xì)胞，加入蛋白裂解液提取細(xì)胞總蛋白，取變性蛋白進(jìn)行SDS-PAGE，每孔蛋白上樣量30 μg，轉(zhuǎn)膜，室溫條件下采用5%脫脂牛奶封閉2 h，加入蛋白一抗稀釋液（1∶500），加入二抗稀釋液（1∶1 000），應(yīng)用凝膠成像系統(tǒng)及Quantity one軟件檢測(cè)條帶灰度值。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度高糖刺激對(duì)人足細(xì)胞miR-103和RCAN1表達(dá)的影響

用不同濃度的高糖刺激足細(xì)胞，結(jié)果顯示，與NG組相比，HG 6 h組、HG 12 h組、HG 24 h組足細(xì)胞中miR-103的表達(dá)水平升高（

P

＜0.05），RCAN1 mRNA及蛋白的表達(dá)水平降低（

P

＜0.05），見(jiàn)圖1、表1。

圖1 檢測(cè)人足細(xì)胞中鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白（RCAN）表達(dá)

表1 不同濃度高糖誘導(dǎo)人足細(xì)胞miR-103和RCAN1的表達(dá)/±s

2.2 不同高糖刺激時(shí)間對(duì)人足細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌的影響

與NG組相比，HG 6h組、HG12 h組、HG 24 h組足細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、IL-6、TNF-α水平升高（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量降低（

P

＜0.05），其中HG12 h作用效果較好，用于后續(xù)研究，見(jiàn)圖2、表2。

表2 不同高糖刺激時(shí)間對(duì)人足細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌的影響/±s

圖2 檢測(cè)人足細(xì)胞凋亡率（A）和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)（B）

2.3 干擾miR-103表達(dá)抑制高糖刺激人足細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HG+antimiR-con組相比，HG+anti-miR-103組高糖刺激的足細(xì)胞中miR-103的表達(dá)水平、細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、IL-6、TNF-α水平降低（

P

＜0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)量升高（

P

＜0.05），見(jiàn)圖3、表3。

表3 干擾miR-103表達(dá)抑制高糖刺激人足細(xì)胞凋亡和炎癥因子分泌/±s

圖3 檢測(cè)人足細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.4 miR-103抑 制RCAN1

miR-103與RCAN1互補(bǔ)的核苷酸序列，見(jiàn)圖4A。轉(zhuǎn)染克隆有RCAN1-3’UTR載體質(zhì)粒實(shí)驗(yàn)中，miR-103組熒光素酶活性明顯受到抑制，與miR-con組比較，熒光素酶活性差異有 統(tǒng) 計(jì) 學(xué)意 義［（1.00±0.08）比（0.43±0.05）］（

t

=18.126，

P

＜0.05）；轉(zhuǎn)染MUT-RCAN1實(shí)驗(yàn)中，miR-con組與miR-103組熒光素酶活性差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義［（0.98±0.11）比（1.16±0.13）］（

t

=3.171，

P

=0.006）。miR-103可 負(fù) 向 調(diào) 控RCAN1的 表 達(dá)。miR-con組、miR-103組、anti-miR-con組、anti-miR-103組RCAN1蛋白水平分別為（0.46±0.06）、（0.21±0.04）、（0.45±0.05）、（0.73±0.07），差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

F

=129.024，

P

＜0.05），見(jiàn)圖4B。

圖4 miR-103與鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白1（RCAN1）互補(bǔ)的核苷酸序列（A）以及miR-103調(diào)控RCAN1表達(dá)（B）

2.5 過(guò)表達(dá)RCAN1抑制高糖刺激人足細(xì)胞凋亡和炎性因子分泌

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，相較于HG+pcDNA組，HG+pcDNA-RCAN1組足細(xì)胞中RCAN1、Bcl-2蛋白表達(dá)量升高（

P

＜0.05），細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、IL-6、TNF-α水平降低（

P

＜0.05），見(jiàn)圖5、表4。

表4 過(guò)表達(dá)RCAN1對(duì)人足細(xì)胞增殖和凋亡的影響/±s

圖5 檢測(cè)人足細(xì)胞中鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白1（RCAN1）表達(dá)和凋亡相關(guān)蛋白表達(dá)

2.6 干擾RCAN1表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-103表達(dá)對(duì)高糖刺激人足細(xì)胞的保護(hù)作用

實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HG+anti-miR-103+si-con組比較，HG+anti-miR-103+si-RCAN1組足細(xì)胞中RCAN1、Bcl-2蛋白表達(dá)量降低（

P

＜0.05），細(xì)胞凋亡率、Bax蛋白表達(dá)量、IL-6、TNF-α水平升高（

P

＜0.05），見(jiàn)表5、圖6。

圖6 檢測(cè)人足細(xì)胞中鈣調(diào)磷酸酶調(diào)節(jié)蛋白1（RCAN1）表達(dá)

表5 干擾RCAN1表達(dá)部分逆轉(zhuǎn)干擾miR-103表達(dá)對(duì)人足細(xì)胞增殖和凋亡的作用/±s

3 討論

糖尿病腎病的主要病理特征為腎小球硬化與足細(xì)胞損傷，臨床癥狀主要為尿素氮排泄障礙與尿蛋白排泄增多。研究表明腎小球?yàn)V過(guò)屏障的主要組成部分是足細(xì)胞，而足細(xì)胞損傷與腎小球疾病密切相關(guān)。因而探究糖尿病腎病足細(xì)胞損傷機(jī)制對(duì)防治糖尿病腎病具有重要意義。

miR-103在缺氧誘導(dǎo)的肺動(dòng)脈高壓鼠的肺組織中表達(dá)升高，并可參與肺動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞的增殖從而促使血管重塑。研究表明miR-103可參與心肌細(xì)胞壞死過(guò)程，抑制miR-103的表達(dá)可抑制心肌細(xì)胞壞死。相關(guān)報(bào)道指出抑制miR-103的表達(dá)可提高2型糖尿病小鼠體內(nèi)葡萄糖穩(wěn)態(tài)及胰島素敏感性。本研究結(jié)果顯示足細(xì)胞中miR-103的表達(dá)水平顯著升高，足細(xì)胞凋亡能力增強(qiáng)，Bax表達(dá)上調(diào)而B(niǎo)cl-2表達(dá)下調(diào)。Bax可促進(jìn)細(xì)胞凋亡，而B(niǎo)cl-2可抑制細(xì)胞凋亡。本研究結(jié)果顯示干擾miR-103的表達(dá)可通過(guò)上調(diào)Bcl-2的表達(dá)及下調(diào)Bax的表達(dá)從而抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡。研究表明足細(xì)胞的凋亡、炎癥及足突異常改變等均可降低腎功能，炎性因子IL-6、TNF-α水平增加導(dǎo)致足細(xì)胞出現(xiàn)炎性反應(yīng)。本研究結(jié)果顯示高糖刺激條件下足細(xì)胞中IL-6、TNF-α含量顯著升高，表明高糖刺激下足細(xì)胞固有免疫被激活從而產(chǎn)生炎性反應(yīng)。本研究發(fā)現(xiàn)干擾miR-103的表達(dá)可降低IL-6、TNF-α水平，提示干擾miR-103的表達(dá)可減輕高糖刺激下足細(xì)胞的炎性反應(yīng)。

RCAN1表達(dá)異常與胰島素抵抗、β細(xì)胞線粒體功能障礙及胰島素分泌功能密切相關(guān)。研究表明RCAN1表達(dá)量降低與2型糖尿病中線粒體功能異常有關(guān)。本研究發(fā)現(xiàn)在高糖刺激的足細(xì)胞中RCAN1表達(dá)量顯著降低，提示RCAN1的表達(dá)變化可能與足細(xì)胞損傷有關(guān)。本研究采用過(guò)表達(dá)載體上調(diào)RCAN1的表達(dá)，通過(guò)觀察足細(xì)胞凋亡及炎性因子分泌情況推斷RCAN1在足細(xì)胞損傷過(guò)程中的作用，結(jié)果顯示RCAN1過(guò)表達(dá)可抑制高糖誘導(dǎo)的足細(xì)胞凋亡，能夠顯著降低IL-6、TNF-α水平，提示RCAN1過(guò)表達(dá)對(duì)足細(xì)胞具有保護(hù)作用。本研究證實(shí)RCAN1是miR-103的靶基因，干擾miR-103的表達(dá)可通過(guò)上調(diào)RCAN1的表達(dá)而保護(hù)糖尿病腎病足細(xì)胞。

綜上所述，糖尿病腎病足細(xì)胞中miR-103表達(dá)升高，而RCAN1表達(dá)下調(diào)，干擾miR-103的表達(dá)可通過(guò)上調(diào)RCAN1的表達(dá)而保護(hù)足細(xì)胞，并可抑制足細(xì)胞凋亡及減輕炎癥反應(yīng)從而避免足細(xì)胞損傷，為臨床治療糖尿病腎病提供新方向。但關(guān)于miR-103與RCAN1是否在內(nèi)皮細(xì)胞與系膜細(xì)胞中表達(dá)仍未可知，仍需進(jìn)一步驗(yàn)證miR-103對(duì)糖尿病腎病病人腎臟損傷的影響。