無患子皂苷的提取及抑菌性研究

邵玲莉，錢思，施曉秦，嚴蘭琴

無患子（Sapindus mukorossi），又名木患子、肥皂樹，是南方常見的行道樹和庭院樹。據(jù)《本草綱目》記載，無患子果皮具有清熱祛痰，消積殺蟲、洗面祛斑等作用，中醫(yī)上可用于咳喘、食滯、白帶、疳積、瘡癬、腫毒等的治療?，F(xiàn)代研究表明，無患子果皮中主要的活性成分為無患子皂苷，它是一種天然的表面活性劑，具有良好的去污性、起泡性和殺菌抑菌、去屑止癢、抗炎、抗病毒、抗氧化以及對污染土壤的修復性等特殊的生物活性，因此在醫(yī)藥、日化以及環(huán)境領(lǐng)域的價值倍受重視，具有很大的開發(fā)潛力和廣闊的市場前景。

無患子皂苷的提取研究較多，傳統(tǒng)方法主要包括水提法和有機溶劑提取法。張永忠等對無患子總皂苷進行超聲提取工藝條件優(yōu)化，其提取率為3.14%，馬麗珍采用水提醇沉法研究了無患子皂苷的提取工藝，無患子皂苷提取率為3.65%，黃素梅等優(yōu)化后的無患子皂苷的提取條件是樣品與乙醇比例為1∶9（質(zhì)量體積比）時，在60℃下提取3次，每次3 h，所得皂苷產(chǎn)率為9.32%，鄭林祿等采用復合酶法探究了無患子皂苷的最佳工藝條件，歐霖拱利用大孔樹脂吸附法對無患子皂苷進行了分離純化，無患子皂苷純度達到90.27%。以上研究取得了一定的效果，但是也存在提取率低、溶劑損失大、或者成本高等局限性。相比傳統(tǒng)的提取方法，超聲波提取法因操作簡單、提取速度快、提取得率高等特點，在天然植物有效成分的提取方面表現(xiàn)出很大的應(yīng)用潛力及良好的發(fā)展前景。本研究以乙醇為溶劑，采用超聲波輔助法提取無患子果皮中的總皂苷。在前期單因素試驗基礎(chǔ)上選取料液比、乙醇體積分數(shù)、超聲時間和提取次數(shù)四個主要影響因素，通過正交試驗優(yōu)化無患子皂苷的提取條件，并對提取液進行抑菌試驗研究，以期為無患子皂苷的進一步開發(fā)利用提供借鑒和參考。本研究起止時間為2018年3月至2019年3月，符合《世界醫(yī)學協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1 材料與方法

1.1 材料

供試材料：無患子果皮，購自金華九德堂大藥房。供試菌種：大腸桿菌（

Escherichia coli

）、枯草芽孢桿菌（

Bacillus subtilis

）、金黃色葡萄球菌（

Staphylococcus aureus.

）、青霉菌（

Penicillium glaucum.

）、黑曲霉（

Aspergillus.niger

）、白色念珠菌（

Candida tropicalis

），均由金華職業(yè)技術(shù)學院醫(yī)學院提供。

試劑：齊墩果酸標準品（上海一基實業(yè)有限公司，批號20180505）；無水乙醇，甲醇，香草醛，冰醋酸，濃硫酸。牛肉膏、蛋白胨、氯化鈉、瓊脂、葡萄糖等試劑均購自金華東南化工儀器有限公司，土豆購自金華農(nóng)貿(mào)市場。

儀器：JY99-Ⅱ型超聲提取裝置（寧波新芝生物科技股份有限公司）；電子精密天平（寧波海曙天宏稱重設(shè)備有限公司）、752紫外可見分光光度計（上海菁華科技儀器有限公司）、旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器RE-52A（上海亞榮生化儀器廠）、J02005型手搖木塞打孔機（浙江上虞醫(yī)療器械廠）、HH-6型數(shù)顯恒溫水?。ǔＶ萏烊饍x器有限公司）；SW-CJ-IF超凈工作臺（蘇州凈化設(shè)備有限公司）；SHP-150生化培養(yǎng)箱（上海森信實驗儀器有限公司）；震蕩培養(yǎng)箱（常州國華電器有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 無患子總皂苷的提取方法準確稱取10.00 g無患子果皮碎末，置錐形瓶中，加入一定量的提取溶劑，搖勻，采用L9（3）正交試驗，利用超聲波輔助法進行提取優(yōu)化。

1.2.2 總皂苷含量測定方法采用比色法標準曲線的制備：精密稱取齊墩果酸標準品10.00 mg，置于燒杯中，用甲醇溶解并定容至10 mL的容量瓶中，搖勻，得1 mg/mL的標準品溶液。分別取0、50、100、150、200、250 μL標準溶液于六支比色管中，揮干溶劑后加入5%香草醛冰醋酸溶液0.3 mL（現(xiàn)配現(xiàn)用）、70%硫酸溶液4.5 mL，混勻，60℃下放置20 min顯色，之后立即用流水冷卻，加2 mL冰醋酸稀釋混勻，以空白溶液作為對照，測553 nm處的吸光度，重復3次。計算回歸方程為y=555.23x-79.201（

R

=0.999 4），線性范圍50～250 μg/mL，線性關(guān)系良好。

樣品總皂苷的含量測定及提取得率計算：將1.2.1項下所得提取液適當稀釋，取0.5 mL溶液于試管中揮干試劑后按上述標準曲線所示方法進行操作，所得吸光度值代入上述回歸方程，按下式計算樣品在不同提取條件下的皂苷提取率。皂苷提取得率（%）=［皂苷質(zhì)量（g）/無患子果皮質(zhì)量（g）］×100%。

1.2.3 抑菌活性測定方法采用濾紙片擴散法，所用濾紙片直徑為6 mm。

牛肉膏蛋白胨培養(yǎng)基：牛肉膏3 g、蛋白胨10 g、氯化鈉5 g、瓊脂15～20 g、加水至1 000 mL。

土豆培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g、葡萄糖20 g、瓊脂15～20 g、加水至1 000 mL。

供試菌種菌懸液的制備：（1）金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、白色念珠菌菌懸液的配制。從4℃的冰箱中取出供試菌種，接種于新鮮液體培養(yǎng)基，在37℃下恒溫培養(yǎng)24 h活化（白色念珠菌在28℃下恒溫培養(yǎng)48 h活化），用移液槍吸取1.0 mL菌原液于9.0 mL無菌水中，得到稀釋10倍的菌懸液，依次操作，直至稀釋度為10，備用。（2）青霉菌、黑曲霉菌懸液的配制。取活化好的黑曲霉菌和青霉菌，用一定量無菌水沖洗孢子，利用比濁法制成110 cfu/mL菌懸液，4℃?zhèn)溆谩?/p>

2 結(jié)果與分析

2.1 無患子總皂苷提取正交試驗

按下表的因素與水平，對無患子皂苷進行提取優(yōu)化。所得提取液過濾后適當稀釋，測吸光度，計算皂苷提取量。見表1。

表1 正交試驗因素、水平及結(jié)果

極差分析表明，各因素的影響主次順序為D＞B＞A＞C，根據(jù)K值的大小可知，因素的最佳水平為ABCD，由于因素A的影響不太顯著，且A與A相比差別不大，因此從節(jié)約溶劑的角度考慮，最終確定的最佳提取工藝為ABCD，即A（固液比）、B（乙醇濃度）、C（超聲時間）、D（提取次數(shù)）分別為1∶5、70%、60 min、3次。在此條件下，無患子總皂苷提取得率為25.33%。

2.2 無患子皂苷抑菌活性試驗

上述優(yōu)化試驗所得提取液利用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮，得到濃度約為1.77 g生藥材/毫升的濃縮液，將已滅菌濾紙片在提取濃縮液中浸泡0.5 h后取出，逐個貼于涂布有金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、黑曲霉、白色念珠菌、青霉菌菌懸液的培養(yǎng)基表面。每個菌種設(shè)3個平行，并以無菌水做對照。細菌于37℃下培養(yǎng)24 h，白色念珠菌于28℃的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，青霉菌和黑曲霉于28℃下培養(yǎng)72 h后觀察。

通過抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，無患子提取液對大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌基本無抑菌效果，對白色念珠菌、黑曲霉及青霉菌抑菌效果明顯。

2.3 最低抑菌濃度的測定

在無患子皂苷抑菌譜研究的基礎(chǔ)上，對濃縮液進行一系列稀釋，測定其最低抑菌濃度。試驗結(jié)果見表2。

表2 抑菌圈長徑/mm

從表2可以看出，無患子提取液濃度不同，其對真菌的抑菌效果也不同，濃度越高，抑菌圈長徑越大，抑菌效果越好。并且，對不同的真菌，抑菌效果不同，對青霉菌的抑菌效果最好，濃縮液稀釋32倍時仍有抑菌效果，即最小抑菌濃度為0.05 g生藥材/毫升提取液。對黑曲霉和白色念珠菌的最小抑菌濃度分別是稀釋度為4倍和16倍。

3 討論

無患子總皂苷的超聲輔助提取中，影響因素較多，除了提取次數(shù)、時間、料液比、乙醇濃度之外，還有超聲波功率、溫度、溶劑等，根據(jù)資料查閱和前期的提取試驗結(jié)果，本研究超聲功率采用200 W，溫度60℃，皂苷提取也可以用水提法，考慮到水提過程中往往會將一些單糖、寡糖、氨基酸、蛋白質(zhì)、黏液質(zhì)等提取出來，雜質(zhì)較多，且苷類物質(zhì)與水接觸時間過長易水解而失去生物活性，因此選用乙醇為提取溶劑。

提取物的抑菌試驗發(fā)現(xiàn)，無患子總皂苷對金黃色葡萄球菌、枯草芽孢桿菌和大腸桿菌等細菌有短時效的抑菌效果，培養(yǎng)20 h時有明顯的抑菌圈出現(xiàn)，但當培養(yǎng)時間延長至30 h后，抑菌圈里會逐漸長出小菌落，所以，總的來說，對上述細菌抑菌效果不明顯。對真菌的抑菌效果顯著，特別是對青霉菌和白色念珠菌，這為進一步開發(fā)利用無患子的藥用價值提供了科學依據(jù)和參考。