舒芬太尼調(diào)控miR-1抑制肝癌細(xì)胞MHCC97-H增殖、侵襲和遷移的機(jī)制研究

曹峰，劉敏,趙瀟

肝細(xì)胞癌是最常見的類型，占肝癌的70%～85%。外科手術(shù)仍是肝癌的主要治療措施，早期肝癌病人通過(guò)手術(shù)治療，如切除部分肝臟或移植，病人5年存活率超過(guò)70%。然而，大多數(shù)中晚期肝癌病人5年生存率約為15%。近期研究顯示，在圍術(shù)期使用的麻醉劑能夠影響病人預(yù)后及腫瘤復(fù)發(fā)。在圍術(shù)期有效抑制腫瘤細(xì)胞生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移是臨床醫(yī)學(xué)研究的熱點(diǎn)。

舒芬太尼是臨床上常用的麻醉誘導(dǎo)和輔助麻醉劑，其屬于苯基哌啶類強(qiáng)效阿片類藥物。目前關(guān)于舒芬太尼對(duì)肝癌細(xì)胞侵襲和遷移影響的研究鮮有報(bào)道，并且其作用機(jī)制尚不明確。多項(xiàng)研究指出微小RNA-1（microRNA-1，miR-1）在人類多種惡性腫瘤，如結(jié)直腸癌、前列腺癌和膀胱癌等中表達(dá)下調(diào)。有關(guān)報(bào)道顯示，miR-1能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。近期有研究顯示，舒芬太尼可通過(guò)調(diào)控miR-1對(duì)大鼠心肌缺血再灌注損傷起保護(hù)作用。提示舒芬太尼可能對(duì)miR-1的表達(dá)具有調(diào)控作用。

本研究起止時(shí)間為2018年3月至2019年9月，通過(guò)觀察舒芬太尼對(duì)人肝癌MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲和遷移及miR-1表達(dá)的影響，探究舒芬太尼對(duì)肝癌細(xì)胞影響的機(jī)制，以期為舒芬太尼在肝癌治療中的應(yīng)用提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

人肝癌細(xì)胞株MHCC97-H購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞研究所；枸櫞酸舒芬太尼注射液購(gòu)自宜昌人福藥業(yè)有限公司；杜氏改良伊格爾培養(yǎng)基（DMEM）培養(yǎng)基購(gòu)自美國(guó)Hyclon公司；胰蛋白酶和新生小牛血清購(gòu)自美國(guó)Gibco公司；Cell Counting Kit（Cell Counting Kit-8，CCK-8）試劑購(gòu)自日本同仁研究所；Trizol試劑購(gòu)自美國(guó)Ambion公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒購(gòu)自賽默飛世爾科技有限公司；SYBR Green PCR Master Mix試劑盒購(gòu)自日本TaKaRa公司；miR-1抑制劑（inhibitor）和陰性對(duì)照均購(gòu)自廣州銳博生物科技有限公司；Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑購(gòu)自美國(guó)Invitrogen公司；Transwell小室購(gòu)自美國(guó)Corning公司；基質(zhì)膠（Matrigel）購(gòu)自美國(guó)BD公司；聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）凝膠配制試劑盒、放射免疫沉淀法（RIPA）細(xì)胞裂解試劑、二喹啉甲酸（BCA）蛋白濃度測(cè)定試劑盒均購(gòu)自上海碧云天生物技術(shù)研究所；鼠抗人基質(zhì)金屬蛋白酶-2（MMP-2）和基質(zhì)金屬蛋白酶-9（MMP-9）單抗及辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG均購(gòu)自美國(guó)CST公司；實(shí)驗(yàn)所用引物均由上海生工生物工程有限公司合成。

1.2 細(xì)胞培養(yǎng)

人肝癌細(xì)胞MHCC97-H常規(guī)復(fù)蘇后培養(yǎng)在含10%滅活小牛血清的DMEM培養(yǎng)基中，加入100 μg/mL青霉素-鏈霉素，放入體積分?jǐn)?shù)為5%二氧化碳、37℃恒溫培養(yǎng)箱中，細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，每隔2天換液1次，待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80%以上時(shí)，以0.25%胰蛋白酶消化細(xì)胞，按照1∶3或1∶4的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

1.3 CCK-8檢測(cè)舒芬太尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞活力的影響

對(duì)數(shù)期的MHCC97-H細(xì)胞以胰酶消化，計(jì)數(shù)后取100 μL細(xì)胞懸液加入到96孔板中，每孔約5×10個(gè)細(xì)胞，放置在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞貼壁后，棄去就培養(yǎng)液，加入含不同濃度（0、0.01、0.1、1、10、20 μmol/L）舒芬太尼的培養(yǎng)液，分別孵育24、48、72 h，在各個(gè)時(shí)間點(diǎn)向細(xì)胞中加入CCK-8溶液20 μL，繼續(xù)孵育4 h，使用酶標(biāo)儀測(cè)定450 nm波長(zhǎng)處吸光度值（optical density，OD），分別計(jì)算各組MHCC97-H細(xì)胞活力，細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對(duì)照組OD值×100%。

1.4 細(xì)胞分組和處理

對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的MHCC97-H細(xì)胞接種到6孔板中，接種密度為2×10個(gè)/孔，于37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)，將細(xì)胞隨機(jī)分為4組：對(duì)照（Control）組即未做任何處理的MHCC97-H細(xì)胞；舒芬太尼（Sufentanil）組即1 μmol/L舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細(xì)胞；舒芬太尼和轉(zhuǎn)染（Sufentanil+miR-1）組即轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor后施加1 μmol/L舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細(xì)胞；舒芬太尼和對(duì)照（Sufentanil+NC）組即轉(zhuǎn)染陰性對(duì)照后施加1 μmol/L舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細(xì)胞。細(xì)胞轉(zhuǎn)染嚴(yán)格參照Lipofectamine 2000轉(zhuǎn)染試劑使用說(shuō)明書進(jìn)行操作，各組MHCC97-H細(xì)胞處理48 h后進(jìn)行相應(yīng)指標(biāo)檢測(cè)。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)

各組MHCC97-H細(xì)胞處理48 h后，收集細(xì)胞，采用Trizol試劑分別提取MHCC97-H細(xì)胞中總RNA，使用Nanodrop超微量核酸蛋白檢測(cè)儀測(cè)定RNA的豐度和純度。選擇合格的RNA進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄，按照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書合成cDNA，以cDNA為模板，以U6為內(nèi)參，采用SYBR Green PCR Master Mix試劑盒進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)程序設(shè)為：94℃預(yù)變性5 min，共1個(gè)循環(huán)；94℃變性30 s，60℃退火30 s，72℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后獲取Ct值，并采用相對(duì)定量2法分別計(jì)算各組MHCC97-H細(xì)胞中miR-1相對(duì)表達(dá)量。所用引物：miR-1 5’-TAGAAGCTTGCCTCTGAGCTGCCTTCTCTA-3’。U6 F-5’-CTTCGGCACGCACATATAC-3’；R-5’-GAACGCTTCACGAATTTGC-3’。

1.6 Western blotting檢測(cè)

各組MHCC97-H細(xì)胞棄去培養(yǎng)液，用預(yù)冷的PBS洗滌細(xì)胞3次，用細(xì)胞刮刮下細(xì)胞，收集細(xì)胞，加入配置好的RIPA細(xì)胞裂解液，于冰上裂解細(xì)胞，離心后收集上清即總蛋白。分別配制12%分離膠和4%濃縮膠，取40 μg蛋白樣品分別加入到每個(gè)泳道中，調(diào)整電壓行SDS-PAGE電泳。電泳結(jié)束后斷開電源，將凝膠上的蛋白采用半干法電轉(zhuǎn)至PVDF膜上，于5%小牛血清的封閉液中孵育2 h，TBST沖洗膜3次，分別加入1∶500稀釋的一抗，冰上過(guò)夜孵育，TBST沖洗膜3次，再加入1∶3 000稀釋的二抗，室溫孵育2 h，TBST沖洗膜3次，化學(xué)發(fā)光顯影，采用成像系統(tǒng)采集圖像，使用Image J軟件分析圖像中的各條帶灰度值，以β肌動(dòng)蛋白（β-actin）進(jìn)行標(biāo)定，計(jì)算各組MGC-803細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白相對(duì)表達(dá)水平。

1.7 Transwell實(shí)驗(yàn)

以胰酶消化各組MHCC97-H細(xì)胞，離心收集并將細(xì)胞密度調(diào)整至2×10個(gè)/毫升。取200 μL細(xì)胞懸液加入到Matrigel基質(zhì)膠包被的Transwell小室的上室，在下室加入含10%小牛血清的培養(yǎng)液600 μL，放置在37℃培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)48 h。取出小室后棄去培養(yǎng)液，使用棉簽輕輕擦去上室未穿膜的細(xì)胞和基質(zhì)膠，經(jīng)無(wú)水甲醇固定后，漂洗晾干，再使用0.1%結(jié)晶紫染色，以PBS洗滌3遍，使用倒置顯微鏡（400倍）觀察，隨機(jī)選取5個(gè)視野觀察并進(jìn)行計(jì)數(shù)穿膜細(xì)胞數(shù)。

1.8 劃痕實(shí)驗(yàn)

將各處理組MHCC97-H細(xì)胞以1×10個(gè)/平鋪于6孔板上，在常規(guī)培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)，待細(xì)胞呈單層匯合時(shí)，用無(wú)菌移液槍槍頭垂直劃線，用PBS洗去劃下的細(xì)胞，加入不含血清的培養(yǎng)液，在37℃培養(yǎng)箱繼續(xù)培養(yǎng)48 h，分別在0和48 h在光鏡下觀察并記錄細(xì)胞劃痕距離。分別計(jì)算各組MHCC97-H細(xì)胞的遷移率，細(xì)胞遷移率（%）=（0 h劃痕距離-48 h劃痕距離）×100%。

2 結(jié)果

2.1 舒芬太尼對(duì)肝癌MHCC97-H細(xì)胞活力的影響

CCK-8檢測(cè)不同濃度舒芬太尼干預(yù)24、48、72 h對(duì)肝癌MHCC97-H細(xì)胞活力的影響，隨著舒芬太尼濃度的升高M(jìn)HCC97-H細(xì)胞活力隨之下降，在干預(yù)24 h時(shí)，舒 芬 太 尼 的 濃 度 達(dá) 到10 μmol/L時(shí)MHCC97-H細(xì)胞活力降低（

P

＜0.05），在干預(yù)48 h時(shí)，舒芬太尼的濃度達(dá)到1 μmol/L時(shí)細(xì)胞活力降低（

P

＜0.05）。基于該實(shí)驗(yàn)篩選出舒芬太尼干預(yù)MHCC97-H細(xì)胞最適作用濃度為1 μmol/L，最適作用時(shí)間為48 h。見表1。

表1 不同濃度的舒芬太尼對(duì)肝癌MHCC97-H細(xì)胞活力的影響/±s

2.2 各組MHCC97-H細(xì)胞miR-1表達(dá)比較

在MHCC97-H細(xì)胞轉(zhuǎn)染miR-1 inhibitor后采用1 μmol/L舒芬太尼進(jìn)行干預(yù)，qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細(xì)胞中miR-1的表達(dá)水平（2.25±0.24）高 于Control組（1.00±0.09）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細(xì) 胞 中miR-1的 表達(dá) 水 平（1.42±0.15）低 于Sufentanil+NC組（2.20±0.21）（

P

＜0.05）；而Sufentanil組和Sufentanil+NC組中miR-1的表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

2.3 各組MHCC97-H細(xì)胞增殖能力比較

CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細(xì)胞OD值（0.34±0.03）明 顯 低 于Control組（0.54±0.05）（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細(xì) 胞OD值（0.46±0.04）明顯高于Sufentanil+NC組（0.32±0.03）（

P

＜0.05）；而Sufentanil組和Sufentanil+NC組細(xì)胞OD值差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。

2.4 各組MHCC97-H細(xì)胞侵襲和遷移能力比較

Transwell實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sufentanil組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯少于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組侵襲細(xì)胞數(shù)明顯多于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）。劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，Sufentanil組細(xì)胞遷移率明顯低于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組細(xì)胞遷移率明顯高于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）。見表2。

表2 各組MHCC97-H細(xì)胞侵襲細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞遷移率比較/±s

2.5 各 組MHCC97-H細(xì) 胞MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平比較

Western blotting檢測(cè)結(jié)果顯示，Sufentanil組MHCC97-H細(xì)胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平低于Control組（

P

＜0.05）；Sufentanil+miR-1組MHCC97-H細(xì) 胞中MMP-2和MMP-9蛋 白表達(dá)水平明顯低于Sufentanil+NC組（

P

＜0.05）；而Sufentanil組 和Sufentanil+NC組 細(xì) 胞 中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見圖1和表3。

圖1 Western blotting檢測(cè)各組MHCC97-H細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平

表3 各組MHCC97-H細(xì)胞中MMP-2和MMP-9表達(dá)水平比較/±s

3 討論

舒芬太尼常做麻醉輔助藥物用于癌癥手術(shù)中，近年來(lái)，舒芬太尼等阿片類藥物對(duì)腫瘤轉(zhuǎn)移和復(fù)發(fā)等影響受到國(guó)內(nèi)外研究者的廣泛關(guān)注。但關(guān)于其對(duì)肝癌細(xì)胞增殖、侵襲和遷移的影響亟待研究。因此，本研究采用不同濃度的舒芬太尼干預(yù)人肝癌MHCC97-H細(xì)胞，CCK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，不同濃度的舒芬太尼對(duì)MHCC97-H細(xì)胞活力具有不同程度的抑制作用?；贑CK-8實(shí)驗(yàn)結(jié)果篩選出最適作用濃度1 μmol/L和最適作用時(shí)間48 h，以用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)加藥標(biāo)準(zhǔn)濃度及處理時(shí)間。此外本實(shí)驗(yàn)qRT-PCR檢測(cè)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼處理后MHCC97-H細(xì)胞中miR-1的表達(dá)水平明顯升高，這與Qiao等人的研究相似，提示舒芬太尼可能調(diào)控miR-1的表達(dá)。

miR-1能夠參與調(diào)控人類多種惡性腫瘤的發(fā)生和進(jìn)展。Xie等報(bào)道指出，miR-1在胃癌組織和細(xì)胞系中的表達(dá)明顯降低，在胃癌細(xì)胞中過(guò)表達(dá)miR-1能夠抑制內(nèi)皮細(xì)胞的增殖、遷移和血管形成，起到腫瘤抑制劑的作用。另一項(xiàng)研究指出，miR-1在卵巢癌組織中表達(dá)下調(diào)，并且可能通過(guò)抑制c-Met表達(dá)抑制卵巢癌細(xì)胞增殖、遷移和侵襲。在肝癌中，miR-1亦呈低表達(dá)，且miR-1可能通過(guò)抑制死亡結(jié)構(gòu)域沉默子（BAG4）的表達(dá)誘導(dǎo)肝癌Hep3B細(xì)胞發(fā)生凋亡。為探究舒芬太尼通過(guò)調(diào)控miR-1的表達(dá)影響肝癌MHCC97-H細(xì)胞體外增殖、侵襲和遷移能力，本研究通過(guò)脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染技術(shù)將miR-1 inhibitor轉(zhuǎn)染至MHCC97-H細(xì)胞下調(diào)miR-1的表達(dá)。CCK-8、Transwell實(shí)驗(yàn)和劃痕實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼能夠抑制MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，而下調(diào)miR-1的表達(dá)能夠部分逆轉(zhuǎn)舒芬太尼誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖、侵襲和遷移抑制作用。本研究表明，舒芬太尼可能通過(guò)調(diào)控miR-1的表達(dá)來(lái)影響MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲和遷移。

腫瘤轉(zhuǎn)移是一個(gè)極其復(fù)雜的過(guò)程，包括腫瘤細(xì)胞從原發(fā)腫瘤部位脫離，侵犯周圍正常組織，并轉(zhuǎn)移到遠(yuǎn)處部位繼續(xù)增殖形成繼發(fā)瘤。在該過(guò)程中，細(xì)胞外基質(zhì)被降解，血管基底膜被破壞，這些均與基質(zhì)金屬蛋白酶密切相關(guān)。MMP-2和MMP-9均屬于基質(zhì)金屬蛋白酶家族重要成員，其主要功能是降解細(xì)胞外基質(zhì)蛋白成分。研究顯示，MMP-2和MMP-9表達(dá)量與腫瘤細(xì)胞侵襲和遷移能力呈正相關(guān)。本研究通過(guò)Western blotting檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，舒芬太尼干預(yù)的MHCC97-H細(xì)胞中MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)降低，而下調(diào)miR-1的表達(dá)后MMP-2和MMP-9蛋白表達(dá)水平可部分恢復(fù)。表明舒芬太尼通過(guò)抑制miR-1的表達(dá)對(duì)MHCC97-H細(xì)胞侵襲和遷移能力的抑制作用可能通過(guò)下調(diào)MMP-2和MMP-9的表達(dá)實(shí)現(xiàn)的。

綜上，本研究發(fā)現(xiàn)舒芬太尼能夠抑制肝癌MHCC97-H細(xì)胞增殖、侵襲和遷移，其作用機(jī)制可能與抑制MHCC97-H細(xì)胞中miR-1的表達(dá)有關(guān)。