不同劑量雷公藤多苷對尋常型銀屑病樣小鼠血清炎性因子的影響

宋穎，朱世文，王曉馨

銀屑病是一種慢性、免疫介導(dǎo)的疾病，全世界約1億人受其影響。從組織學(xué)方面講，角質(zhì)形成的細(xì)胞增殖、表皮網(wǎng)狀角化過度和表皮增厚都能引起銀屑病。盡管銀屑病的確切病因尚不清楚，但是越來越多的研究表明，炎性細(xì)胞因子和趨化因子的產(chǎn)生會促進疾病的發(fā)展，因此抗炎成為治療銀屑病的一種有效方式。其中白細(xì)胞介素-6（IL-6）、白細(xì)胞介素-17（IL-17）、白細(xì)胞介素-23（IL-23）、腫瘤壞死因子-α（TNF-α）和核轉(zhuǎn)錄因子-κB（NF-κB）等細(xì)胞因子在銀屑病的發(fā)生發(fā)展過程中具有重要作用。

在銀屑病等皮膚疾病治療過程中，天然產(chǎn)物備受青睞，雷公藤多苷（Tripterygium glycosides）的多種生物活性受到廣泛關(guān)注和研究。雷公藤多苷是源于雷公藤根的一種脂溶性混合物，可影響炎癥過程和免疫疾病，因此具有抗炎和免疫調(diào)節(jié)等作用。但雷公藤多苷的標(biāo)準(zhǔn)提取物較為單一，可能會引起較為嚴(yán)重的臨床不良反應(yīng)，導(dǎo)致其在治療銀屑病時沒有標(biāo)準(zhǔn)用量。本研究通過觀察不同劑量雷公藤多苷對銀屑病樣小鼠血清炎性因子的影響，探討其最佳治療劑量，為病人合理用藥提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物和試劑

40只雄性BALB/c小鼠（18～20 g）由陜西中藥研究所［SYXK（陜）2016-003］提供，研究時間為2019年2—11月。雷公藤多苷片由浙江得恩德制藥有限公司生產(chǎn)；咪喹莫特（IMQ）乳膏由珠海聯(lián)邦制藥股份有限公司生產(chǎn)。ELISA試劑盒購于Sigma；超氧化物歧化酶（SOD）活性測試試劑盒和谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）水平測定試劑盒購買于Biovision；抗TNF-α和NF-κB一抗和二抗購買于Sino Biological；HaCat細(xì)胞購買于中科院細(xì)胞庫；DMEM培養(yǎng)基、10%胎牛血清和青鏈霉素雙抗購買于Thermo。

1.2 方法

1.2.1 動物分組及造模將40只BALB/c雄性小鼠置于動物飼養(yǎng)室飼養(yǎng)，飼養(yǎng)環(huán)境為實驗動物生長的標(biāo)準(zhǔn)環(huán)境，用標(biāo)準(zhǔn)嚙齒類動物飼料進行喂養(yǎng)，適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后將小鼠編號并采用隨機數(shù)字表法分為五組：對照組，模型組，低、中、高劑量給藥組，每組8只。采用IMQ誘導(dǎo)進行尋常型銀屑病造模：小鼠連續(xù)7 d接受每天62.5 mg的5% IMQ乳膏涂抹在其背部3 cm×2.5 cm的剃毛區(qū)域，而模型組在剃毛后則涂抹等量凡士林，對照組僅剃毛，不做任何處理。造模成功后，給藥組分別灌胃10 mg·kg·d、20 mg·kg·d和40 mg·kg·d的雷公藤多苷，連續(xù)灌胃14 d。

1.2.2 細(xì)胞造模將復(fù)蘇后的細(xì)胞正常培養(yǎng)及傳代，選擇生長旺盛、形態(tài)良好的細(xì)胞接種于24孔板上，每孔加入1.5 mL的完整培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h，待細(xì)胞貼壁后，分別加入濃度為50 μg/L的γ-干擾素（IFN-γ）和10 μg/L的IL-6刺激因子刺激細(xì)胞48 h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實驗。

1.2.3 細(xì)胞培養(yǎng)HaCat細(xì)胞分為四組：對照組，以及低、中、高劑量給藥組。細(xì)胞培養(yǎng)在完全培養(yǎng)基中（DMEM+10%胎牛血清+青鏈霉素雙抗），給藥組的培養(yǎng)基中分別加入濃度梯度為10 mg/L、20 mg/L及40 mg/L的雷公藤多苷，細(xì)胞培養(yǎng)瓶置于37℃、二氧化碳濃度為5%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.2.4 小鼠皮膚組織SOD活性及GSH和MDA水平測定灌胃14 d后收集皮膚組織在Tris緩沖液（20mmol/L，pH 7.5）中均質(zhì)化，然后12 000 r/min離心10 min收集上清液。所有操作均在4℃環(huán)境中進行。上清液用于SOD活性及GSH和MDA水平測定。以牛血清蛋白為標(biāo)準(zhǔn)，通過Bradford方法測定上清液中蛋白質(zhì)的濃度。所有測定實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，重復(fù)3次。

1.2.5 ELISA分析所有小鼠在灌胃14 d后用3%戊巴比妥鈉溶液麻醉。腹腔靜脈取全血，分離血清，使用酶聯(lián)免疫吸附測定（ELISA）試劑盒測定IL-1、IL-6、IL-18和IL-23水平。所有測定實驗嚴(yán)格按照試劑盒說明書進行，重復(fù)3次。

1.2.6 蛋白質(zhì)印跡法從收集到的小鼠全血和病變皮膚中獲得總蛋白樣品，在4℃離心機中12 000 r/min離心5 min。蛋白樣品通過十二烷基磺酸納一聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）在80 V下電泳0.5 h，在120 V下電泳1.5 h。分離的蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移到PVD膜上30 min。用含有0.1%的吐溫20緩沖液孵育1 h后，用抗TNF-α和NF-κB一抗在4°C下孵育過夜。緩沖液洗滌3次后，用辣根過氧化物酶偶聯(lián)的二抗孵育1 h。顯影拍照后用使用Image J軟件分析圖像。

1.2.7 流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的周期變化細(xì)胞培養(yǎng)48 h后，采用不含EDTA的0.25%胰酶消化處理，終止消化后，于1 500 r/min離心處理5 min，然后收集細(xì)胞。PBS液洗滌細(xì)胞沉淀2次，加入預(yù)冷的70%甲醇1 mL，于4℃環(huán)境下固定4 h。然后再加入含有100 mg/L RNase A的PBS液500 μL，于37℃環(huán)境孵育30 min，完成后，再加入PI調(diào)整濃度為50 mg/L。避光37℃孵育30 min。取200 μL的單細(xì)胞懸液，流式上機檢測。

2 結(jié)果

2.1 雷公藤多苷調(diào)節(jié)小鼠病變皮膚組織中SOD活性及GSH和MDA水平

結(jié)果顯示（表1），與對照組比較，模型組小鼠的GSH水平和SOD活性均顯著降低（

P

=0.002；

P

=0.007），給藥組的GSH水平和SOD活性高于模型組，其中中劑量組最高（

P

＜0.001，

P

=0.003），低劑量組最低（

P

=0.004；

P

=0.037）；模型組小鼠MDA水平高于對照組（

P

＜0.001），經(jīng)過藥物治療處理后MDA水平降低（

P

＜0.001）。這些結(jié)果表明，20 mg·kg·d的雷公藤多苷可以明顯抑制MDA水平，可以有效調(diào)節(jié)IMQ誘導(dǎo)的小鼠體內(nèi)的氧化/抗氧化狀態(tài)，從而達到更有利的生理平衡。

表1 小鼠病變皮膚組織中SOD活性及GSH和MDA水平/±s

2.2 ELISA分析 小鼠血 清IL-6、IL-17、IL-23和

TNF-α

結(jié)果顯示（表2），模型組小鼠血清中IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α水平相較于對照組升高（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

=0.011），表明IMQ誘導(dǎo)的銀屑病可引起小鼠血清炎性因子升高；而低劑量組的IL-17和TNF-α表達水平與模型組相比差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.068，

P

=0.98），中劑量組和高劑量組小鼠血清炎性因子下降（

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

＜0.001，

P

=0.041）。

表2 銀屑病樣小鼠血清中炎性因子表達水平/（pg/mg，±s）

2.3 Western blotting分析小鼠皮膚中NF-κB水平

Western blotting分析雷公藤多苷對NF-κB蛋白表達影響的結(jié)果表明（圖1），模型組小鼠的NF-κB表達水平相較于對照組升高（

P

＜0.001），而各個給藥組的小鼠NF-κB表達水平發(fā)生降低（

P

=0.005），且中劑量組的抑制效果最佳（

P

＜0.001）（圖1）。

圖1 Western blotting檢測小鼠病變皮膚中NF-κB表達水平

2.4 不同劑量雷公藤多苷對各組細(xì)胞周期的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測各組細(xì)胞的周期變化情況結(jié)果表明（表3），與對照組相比，低劑量組（10 mg/L）雷公藤多苷處理48 h的HaCat細(xì)胞的G1期細(xì)胞所占比例差異無統(tǒng)計學(xué)意義（

P

=0.3），而中劑量組（20 mg/L）和高劑量組（40 mg/L）雷公藤多苷處理48 h后細(xì)胞G1期細(xì)胞所占比例升高（

P

＜0.001，

P

=0.013），即細(xì)胞阻滯在G1期。

表3 不同劑量雷公藤多苷對各組小鼠組織細(xì)胞周期的影響/（%，±s）

3 討論

銀屑病的治療一直是皮膚病領(lǐng)域重要的問題和研究熱點。本研究結(jié)果表明，IMQ誘導(dǎo)的尋常型銀屑病樣小鼠的MDA水平升高，同時GSH水平和SOD活性降低，這表明氧化應(yīng)激在銀屑病發(fā)病機制中起關(guān)鍵作用。而雷公藤多苷處理導(dǎo)致給藥組小鼠SOD活性增加，GSH水平上升和MDA水平下降，這表明，雷公藤多苷可通過抗氧化機制抑制銀屑病的發(fā)展。同時我們發(fā)現(xiàn)，中劑量（20 mg·kg·d）灌胃組的抗氧化效果最好，高劑量（40 mg·kg·d）灌胃組的小鼠抗氧化效果略有下降。

研究表明，T細(xì)胞介導(dǎo)了銀屑病的發(fā)生；幾種全身性促炎細(xì)胞因子（IL-6、IL-17、IL-23和TNF-α）也是銀屑病的主要參與者。喬菊等研究表明，銀屑病病人的組織和血清中TNF-α、IL-17A、IL-23和IL-36γ水平升高；其中TNF-α不僅增加了其他促炎細(xì)胞因子的產(chǎn)生，還誘導(dǎo)了NF-κB的產(chǎn)生并影響細(xì)胞的增殖和存活。研究表明，在牛皮癬病人的皮膚和血清中，IL-6水平顯著增加，這說明IL-6是潛在用于治療牛皮癬的靶標(biāo)細(xì)胞因子。IL-17能誘導(dǎo)人皮膚角質(zhì)細(xì)胞中形成IL-6、IL-8和CXCL5，間接促進嗜中性粒細(xì)胞的分化、活化和遷移。因此，在本研究中檢測了細(xì)胞因子TNF-α、IL-6、IL-17和IL-23的變化趨勢。結(jié)果表明，用不同劑量的雷公藤多苷灌胃小鼠后，上述幾種細(xì)胞因子表達水平顯著降低，小鼠的炎癥狀態(tài)得到了有效改善；但低劑量組的小鼠血清細(xì)胞因子沒有明顯變化，劑量升高后細(xì)胞因子水平才發(fā)生顯著下降。Western blotting結(jié)果也表明，雷公藤多苷可以抑制NF-κB的表達水平。

本研究的實驗結(jié)果與高軍等研究結(jié)果一致，雷公藤多苷可抑制尋常銀屑病樣小鼠血清NF-κB的表達水平，從而對T細(xì)胞的活化與增殖產(chǎn)生抑制作用。而T細(xì)胞在銀屑病的發(fā)病機制中起著重要作用。IL-23/Th17通路被認(rèn)為是銀屑病發(fā)病的中心，而TNF-α和IL-17可根據(jù)其作用方式分為調(diào)節(jié)性和效應(yīng)性細(xì)胞因子。同時TNF-α和IL-6的表達又受到NF-κB的調(diào)控，因此NF-κB可能是雷公藤多苷影響尋常型銀屑病樣小鼠促炎細(xì)胞因子的關(guān)鍵因子。研究表明，雷公藤多苷導(dǎo)致的抗增殖、促凋亡、抗炎作用與其抗銀屑病作用有關(guān)。因此我們通過流式細(xì)胞術(shù)檢測其對各組細(xì)胞周期的影響。結(jié)果表明，雷公藤多苷處理細(xì)胞后，會將銀屑病模型細(xì)胞的細(xì)胞周期阻滯在G1期。這表明，雷公藤多苷可通過抑制細(xì)胞增殖而抑制銀屑病的發(fā)展，這可能與雷公藤多苷抑制Wnt/Frizzled信號傳導(dǎo)通路有關(guān)。

綜上所述，雷公藤多苷通過調(diào)節(jié)細(xì)胞周期和促炎細(xì)胞因子改善了IMQ誘導(dǎo)的小鼠牛皮癬樣皮膚損傷的嚴(yán)重程度，而抑制NF-κB可能是雷公藤多苷影響尋常型銀屑病小鼠促炎細(xì)胞因子的關(guān)鍵步驟，當(dāng)然這還需進一步實驗驗證。同時實驗結(jié)果表明，雷公藤多苷抗銀屑病的有效劑量在20～40 mg·kg·d，但還需進一步研究以確定其臨床最佳使用劑量。