白花蛇舌草總黃酮通過下調(diào)NOX4表達(dá)對前列腺癌細(xì)胞侵襲、遷移、EMT的影響

秦瑞，施曉星

前列腺癌是臨床常見的惡性腫瘤，發(fā)病率、病死率較高，近年來其發(fā)病率年年增長，病人也有年輕化的趨勢。前列腺癌因早期無明顯臨床癥狀，病人大多是中晚期，此時多數(shù)病人癌細(xì)胞會發(fā)生轉(zhuǎn)移，侵襲至膀胱、精囊及骨骼等，引起血尿、骨痛、骨折或截癱等癥狀，嚴(yán)重危害病人的身心健康，因此抑制癌細(xì)胞的侵襲轉(zhuǎn)移是治療前列腺癌的重要環(huán)節(jié)。白花蛇舌草是一年生茜草科草本植物，總黃酮是其主要有效成分，具有清熱解毒、消腫利尿、抗腫瘤之功效，臨床中常做為治療多種癰癤膿腫及癌癥的輔助藥物。研究發(fā)現(xiàn)，白花蛇舌草可抑制肺癌細(xì)胞、肝癌細(xì)胞、大腸癌細(xì)胞等的增殖，并可抑制其侵襲轉(zhuǎn)移，因而白花蛇舌草總黃酮可能也對前列腺癌細(xì)胞具有相同的作用。尼克酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸氧化酶4（NOX4）可以介導(dǎo)上皮細(xì)胞向間質(zhì)細(xì)胞的轉(zhuǎn)化過程（EMT），EMT是腫瘤發(fā)生侵襲轉(zhuǎn)移的必要過程，與其密切相關(guān)，NOX4可通過上調(diào)兩面神激酶2（JAK2）/信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）信號通路增強(qiáng)胃癌的發(fā)展及侵襲轉(zhuǎn)移，但白花蛇舌草總黃酮是否可通過下調(diào)NOX4表達(dá)抑制前列腺癌pc-3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移目前并不清楚，本研究對白花蛇舌草總黃酮是否可通過下調(diào)NOX4表達(dá)抑制前列腺癌pc-3細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移進(jìn)行了研究探索。

1 材料與方法

1.1 試劑與材料

白花蛇舌草，購自上海源葉生物科技有限公司；pc-3細(xì)胞（貨號JN-B1650），購自上海紀(jì)寧生物科技有限公司；氯化二亞苯基碘鎓（DPI）（貨號S863901），購自Selleck公司；DMEM高糖培養(yǎng)基（貨號10566016）和胎牛血清FBS（10099-141）、胰蛋白酶（貨號15050057）、青鏈霉素（貨號10378016）購自美國Gibco公司；SDS-PAGE凝膠制備試劑盒、PBS緩沖液購于Solarbio試劑公司；兔源GAPDH抗體（貨號ab181602）、鈣黏蛋白E（E-cadherin）（貨號ab76319）抗體、波形纖維蛋白（Vimentin）（貨號ab193555）、NOX4抗體（貨號ab133303）、兩面神激酶2（JAK2）（貨號ab133666）、磷酸化兩面神激酶2（Phosphorylated janus kinase 2，p-JAK2）抗體（貨號ab138005）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（STAT3）抗體（貨號ab68153）、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄活化因子3（Phosphorylated signal transducers and activators of transcnption 3，p-STAT3）抗 體（貨 號ab76315）、羊抗兔二抗（貨號ab150077），購自美國Abcam公司；伊紅染色液（貨號C0109）、蛋白裂解液（貨號P0013K）、細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑（Cell Counting Kit，CCK-8）試劑盒（貨號C0037）、雙金雞納酸（bicinchoninic acid，BCA）m試劑盒（貨號P0011）、96孔板、25cm培養(yǎng)瓶、6孔板、EP管、移液槍槍頭，購自上海碧云天公司。本研究符合《世界醫(yī)學(xué)協(xié)會赫爾辛基宣言》相關(guān)要求。

1.2 主要儀器

Olympus CKX41顯微鏡，德國Leica公司生產(chǎn)；凝膠成像儀，日本尼康公司生產(chǎn)；蛋白電泳儀、轉(zhuǎn)膜儀，美國Bio-Rad公司生產(chǎn)；制冰機(jī)、恒溫水浴鍋，購自廣州藝佳生物等。

1.3 方法

1.3.1 細(xì)胞培養(yǎng)及白花蛇舌草總黃酮制備將購買的人前列腺癌細(xì)胞pc-3細(xì)胞解凍復(fù)蘇，接種于含10%胎牛血清、100 U/mL青鏈霉素的高糖DMEM培養(yǎng)基中，置于37℃、5%二氧化碳、95%濕度的恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細(xì)胞在25 cm培養(yǎng)瓶底長至85%左右時，吸出培養(yǎng)液，PBS洗滌1次，加入胰蛋白酶2 mL消化處理后，以1∶3的比例進(jìn)行傳代培養(yǎng)。

稱100 g白花蛇舌草藥材置于石油醚脫脂2次，然后以2 000 mL 70%乙醇溶液超聲提取30 min，抽濾，重復(fù)3次，合并濾液后濃縮，以D101大孔樹脂純化，并依次采用40%、60%、70%乙醇溶液洗脫，收集最后的洗脫液，濃縮、冷凍干燥后的白花蛇舌草總黃酮提取物，測定其含量后，以高糖DMEM培養(yǎng)基溶解制備成濃度為20 g/L的溶液，過濾除菌后備用。

1.3.2 CKK-8實(shí)驗(yàn)取1.2.1中的對數(shù)生長期的細(xì)胞，使用0.25%胰酶消化后收集并計(jì)數(shù)，以每孔約0.6×10個的細(xì)胞密度接種于96孔板中，培養(yǎng)24 h后參照文獻(xiàn)，分別加入0.1 g/L、0.25 g/L、0.5 g/L濃度的白花蛇舌草總黃酮，10 μmol/L DPI處理細(xì)胞，設(shè)置對照組，每組設(shè)置4個孔作為重復(fù)，在24 h、48 h后加入CKK-8試劑，繼續(xù)培養(yǎng)2 h，振蕩混勻后于全自動酶標(biāo)儀中檢測450 nm波長下各孔吸光度（optical density，OD），計(jì)算各個濃度的細(xì)胞活力，實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。公式為：細(xì)胞活力（%）=實(shí)驗(yàn)組OD值/對照組OD值×100%。

1.3.3 藥物及細(xì)胞處理和分組取DPI以DMEM細(xì)胞培養(yǎng)基配制為10 μmol/L的溶液，過濾除菌后備用。

1.2.1 中的細(xì)胞，長至85%左右時，以0.25%胰酶消化后以1∶3的比例接種于6孔板中，細(xì)胞分為五組：空白對照組、白花蛇舌草總黃酮（0.1 g/L）組；白花蛇舌草總黃酮（0.25 g/L）組；白花蛇舌草總黃酮（0.5 g/L）組、DPI組，培養(yǎng)過夜后以上述濃度的白花蛇舌草總黃酮及DPI處理細(xì)胞，16 h后使用0.25%胰酶消化收集各組細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3.4 Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)的方法，取1.2.3中收集的各組細(xì)胞，以無血清的DMEM培養(yǎng)基分別重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整濃度為5×10個/mL，取200 μL細(xì)胞懸液加入基質(zhì)膠包被過的Transwell上室，下室加入細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含有10%FBS），在二氧化碳恒溫培養(yǎng)箱培養(yǎng)24 h后，取出小室，棄去培養(yǎng)液，用PBS漂洗干凈，每孔加入500 μL濃度為4%的多聚甲醛室溫下固定20 min，用棉簽擦去基質(zhì)膠和上室內(nèi)的細(xì)胞，用0.5%伊紅染色，在Olympus CKX41顯微鏡下觀察并拍照，記錄穿膜細(xì)胞數(shù)目，以此作為評判細(xì)胞侵襲能力的指標(biāo)。

1.3.5 細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)參照文獻(xiàn)的方法，取1.2.3中收集的各組細(xì)胞，以細(xì)胞完全培養(yǎng)基（含有10%FBS）分別重懸后計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞數(shù)目為5×10個/毫升，接種于6孔板中，以無菌直尺做標(biāo)尺，使用200 μL槍頭在六孔板中心畫一條直線，用PBS漂洗干凈劃痕中的細(xì)胞，然后加入完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，24 h后在Olympus CKX41顯微鏡下觀察并拍照，記錄遷移細(xì)胞數(shù)目，以此作為評判細(xì)胞遷移能力的指標(biāo)。

1.3.6 免疫印跡實(shí)驗(yàn)取1.2.3中收集的各組細(xì)胞，加入適宜的蛋白裂解液（含有蛋白酶抑制劑）在4℃下裂解細(xì)胞1 h，以3 000 r/min的速度4℃下離心20 min，取上清液使用BCA試劑盒測定蛋白濃度，調(diào)整各組細(xì)胞蛋白濃度相同，各取20 μL蛋白做SDS-凝膠電泳使之分離，濕轉(zhuǎn)將蛋白全轉(zhuǎn)移至硝酸纖維膜上，在5%的脫脂奶粉中室溫封閉1 h，根據(jù)分子量截取目的蛋白條帶，分別加入E-cadherin、Vimentin、NOX4、JAK2、p-JAK2、STAT3、p-STAT3、GAPDH一抗，4℃孵育過夜，TBST漂洗3次，加入羊抗兔二抗，室溫孵育2 h。經(jīng)增強(qiáng)型化學(xué)發(fā)光法顯色，在凝膠成像儀中觀察結(jié)果，以Tanon軟件拍攝圖像并進(jìn)行分析。

2 結(jié)果

2.1 白花蛇舌草總黃酮對pc-3細(xì)胞活力的影響

與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度和DPI處理pc-3細(xì)胞后，都能在24 h、48 h抑制其細(xì)胞活力，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），且白花蛇舌草總黃酮各濃度之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見表1，為使檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力的結(jié)果盡量準(zhǔn)確，應(yīng)盡力避免藥物抑制增殖作用對實(shí)驗(yàn)的干擾，故選擇藥物處理16 h后檢測細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力。

表1 白花蛇舌草總黃酮對pc-3細(xì)胞活力的影響/x±s

2.2 白花蛇舌草總黃酮對pc-3細(xì)胞遷移、侵襲的影響

與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度組和DPI組遷移的pc-3細(xì)胞數(shù)目明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），且白花蛇舌草總黃酮各濃度組之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度組和DPI組侵出transwell小室的pc-3細(xì)胞數(shù)目明顯降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），且白花蛇舌草總黃酮各濃度組之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05）。見表2。

表2 白花蛇舌草總黃酮對pc-3細(xì)胞遷移、侵襲的影響/（個，x±s）

2.3 白花蛇舌草總黃酮對EMT標(biāo)志蛋白的影響

與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度組和DPI組E-cadherin蛋白表達(dá)升高、Vimentin蛋白表達(dá)降低，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＜0.05），且白花蛇舌草總黃酮各濃度組之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見表3。

表3 白花蛇舌草總黃酮對EMT標(biāo)志蛋白的影響/x±s

2.4 白花蛇舌草總黃酮對NOX4蛋白及下游JAK2/STAT3信號通路的影響

與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度組和DPI組NOX4蛋白表達(dá)及JAK2/STAT3信號通路相關(guān)蛋白p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3降低（

P

＜0.05），且白花蛇舌草總黃酮各濃度組之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（

P

＞0.05），見圖1和表4。

表4 白花蛇舌草總黃酮對NOX4蛋白及下游JAK2/STAT3信號通路的影響/x±s

圖1 白花蛇舌草總黃酮對NOX4蛋白及下游JAK2/STAT3信號通路的影響

3 討論

前列腺癌是男性易患的惡性腫瘤，全世界每年大約有20萬人因前列腺癌死亡，目前還沒有非常有效的治療手段。白花蛇舌草能抑制腫瘤細(xì)胞的生長，增強(qiáng)機(jī)體免疫力、調(diào)控癌細(xì)胞能量代謝、誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡、抑制腫瘤轉(zhuǎn)移及血管生成等機(jī)制起到抗腫瘤作用，對多種癌癥有較好的臨床療效。本研究結(jié)果顯示，白花蛇舌草總黃酮和DPI處理pc-3細(xì)胞24 h、4 8h后能夠降低其細(xì)胞活力，且白花蛇舌草總黃酮各濃度之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比，細(xì)胞活力差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明白花蛇舌草總黃酮可以抑制pc-3細(xì)胞的增殖，揭示其對治療前列腺癌可能具有一定的療效。

白花蛇舌草可以抑制前列腺癌細(xì)胞的增殖，但白花蛇舌草對前列腺癌侵襲轉(zhuǎn)移的作用及其具體的作用機(jī)制目前還不清楚，本研究根據(jù)上述增殖實(shí)驗(yàn)結(jié)果，為減少對細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移能力檢測的干擾，選擇藥物處理pc-3細(xì)胞16 h后做Transwell侵襲實(shí)驗(yàn)和細(xì)胞劃痕實(shí)驗(yàn)，結(jié)果顯示，與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度和DPI處理pc-3細(xì)胞后，侵出transwell小室和遷移的pc-3細(xì)胞數(shù)目明顯降低，且白花蛇舌草總黃酮各濃度組之間有濃度依賴性，揭示白花蛇舌草總黃酮能夠降低pc-3細(xì)胞侵襲遷移能力，在前列腺癌的治療中，對防止及抑制癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移預(yù)計(jì)會有較好的效果。

癌細(xì)胞的轉(zhuǎn)移通常會發(fā)生上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過程，其是癌細(xì)胞增加侵襲力及向機(jī)體別處遷移的關(guān)鍵步驟。腫瘤細(xì)胞發(fā)生EMT過程時，細(xì)胞極性及與上皮細(xì)胞表型逐漸消失，漸漸轉(zhuǎn)化為具有較高遷移與侵襲能力的間質(zhì)細(xì)胞表型，期間上皮細(xì)胞標(biāo)志蛋白E-cadherin表達(dá)降低，同時間質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志蛋白Vimentin表達(dá)升高。有研究表明JAK2/STAT3信號通路在腫瘤轉(zhuǎn)移過程中起著重要調(diào)控作用，激活該信號，JAK2和STAT3的磷酸化水平升高，可降低E-cadherin表達(dá)，升高Vimentin表達(dá)，促進(jìn)EMT及腫瘤的發(fā)生發(fā)展，下調(diào)該信號，可顯著抑制大腸癌和結(jié)直腸癌的腫瘤生長和轉(zhuǎn)移。NOX4能夠通過介導(dǎo)JAK2/STAT3信號來調(diào)控腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移能力，下調(diào)NOX4表達(dá)，能阻滯JAK2/STAT3信號傳導(dǎo)，抑制胃癌的侵襲。因此，阻斷通過降低NOX4表達(dá)下調(diào)JAK2/STAT3通路可能是白花蛇舌草總黃酮抑制前列腺癌遷移侵襲的藥理機(jī)制，研究結(jié)果顯示，與空白對照組相比，白花蛇舌草總黃酮各濃度組和DPI組E-cadherin蛋白表達(dá)升高、Vimentin、NOX4蛋白表達(dá)及JAK2/STAT3通路相關(guān)蛋白p-JAK2/JAK2、p-STAT3/STAT3降低，且白花蛇舌草總黃酮各濃度組之間有濃度依賴性，白花蛇舌草總黃酮高濃度組與DPI組相比蛋白表達(dá)水平差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，說明白花蛇舌草總黃酮可以下調(diào)NOX4蛋白表達(dá)，下調(diào)JAK2/STAT3信號通路，抑制EMT的發(fā)生，暗示白花蛇舌草總黃酮可以通過抑制NOX4表達(dá)來下調(diào)JAK2/STAT3信號，這可能是其抑制EMT發(fā)生，降低癌細(xì)胞侵襲轉(zhuǎn)移力的分子機(jī)制。

總之，白花蛇舌草總黃酮能夠抑制前列腺癌細(xì)胞增殖，降低其侵襲轉(zhuǎn)移力，通過抑制NOX4表達(dá)來下調(diào)JAK2/STAT3信號通路可能是其發(fā)揮作用的分子機(jī)制，但本文未通過上調(diào)NOX4表達(dá)進(jìn)行對照驗(yàn)證，存在一定不足，還需要后續(xù)深入研究。