五子衍宗方免煎顆粒對實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎小鼠炎性反應(yīng)的影響及機(jī)制

王旭，李艷榮，樊慧杰，孫芮芮，賈多，賈璐，呂建軍，肖保國，馬存根，4，柴智 （.山西藥科職業(yè)學(xué)院中藥系，山西 太原 000；.山西中醫(yī)藥大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山西 晉中 0069；.復(fù)旦大學(xué)華山醫(yī)院神經(jīng)病學(xué)研究所，上海 0005；4.山西大同大學(xué)腦科學(xué)研究所，山西 大同 07009）

多發(fā)性硬化（Multiple sclerosis，MS）以中樞神經(jīng)系統(tǒng)慢性炎性脫髓鞘病變?yōu)樘攸c(diǎn)，主要累及脊髓和白質(zhì)，表現(xiàn)為神經(jīng)功能缺損[1]。該疾病的發(fā)病具有遺傳易感性，患者成年早期發(fā)病率高，且女性高于男性，大部分患者反復(fù)發(fā)作，伴隨空間多發(fā)性和時間多發(fā)性，極易致殘[2]。MS 的病理過程涉及炎性反應(yīng)如γ 干擾素（IFN-γ）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）、白細(xì)胞介素17（IL-17）等炎性因子的釋放，大量炎性細(xì)胞浸潤是MS 的病理特征，炎癥在MS 的各個階段都會導(dǎo)致脫髓鞘及組織損傷[3]。抑制炎性反應(yīng)可有效延緩MS 的病程和進(jìn)展[4]。實(shí)驗(yàn)性自身免疫性腦脊髓炎（Experimental allergic encephalomyelitis，EAE）模型是以特異性致敏的CD4+T 細(xì)胞介導(dǎo)為主的，以中樞神經(jīng)系統(tǒng)內(nèi)小血管周圍出現(xiàn)單個核細(xì)胞浸潤及髓鞘脫失為特征的自身免疫性疾病，是人類MS 的理想動物模型，被廣泛應(yīng)用于MS 的實(shí)驗(yàn)研究[5-6]。中醫(yī)藥在改善MS 患者疾病癥狀、穩(wěn)定疾病發(fā)展及整體調(diào)節(jié)等方面具有獨(dú)特優(yōu)勢[7]。本課題組前期研究表明，經(jīng)典補(bǔ)腎名方五子衍宗丸能夠改善EAE 小鼠神經(jīng)功能評分[8]，對脫髓鞘模型小鼠有促進(jìn)再髓鞘化的作用[9]，可能與降低炎癥因子分泌進(jìn)而改善炎性環(huán)境有關(guān)。故本研究擬基于EAE 小鼠模型進(jìn)一步探討五子衍宗方免煎顆粒對MS 炎性反應(yīng)的影響及機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 動物 8～10 周齡雌性C57BL/6 小鼠36 只，SPF級，體質(zhì)量（20±2）g，購自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動物科技有限公司，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號：SCXK（京）2017-0011。本實(shí)驗(yàn)經(jīng)山西中醫(yī)藥大學(xué)倫理委員會批準(zhǔn)，動物倫理審批號：2018DW116。動物適應(yīng)性飼養(yǎng)1 周后進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。

1.2 藥物及試劑 每1 g 五子衍宗方免煎顆粒由菟絲子（炒）0.56 g、枸杞子0.07 g、覆盆子0.139 g、鹽車前子0.21 g、五味子（蒸）0.021 g 五味藥組成，原方配伍比例為8∶8∶4∶2∶1。本研究所用五子衍宗方免煎顆粒均購自太原市同仁堂藥店，批號：16091703。將五子衍宗方免煎顆粒研磨成微細(xì)粉末狀，用0.9%生理鹽水溶解配制成0.32 g·mL-1溶液備用，使用前充分搖勻。

髓鞘少突膠質(zhì)細(xì)胞糖蛋白多肽35-55（MOG35-55），上海強(qiáng)耀生物科技有限公司，批號：9001；百日咳毒素，美國Sigma 公司，批號：231144；結(jié)核分枝桿菌，美國Becton Dickinson 公司，批號：231141；完全弗氏佐劑，美國Alexis 公司，批號：60301；HE染色試劑盒（貨號：G1120-100），LFB 染色試劑盒（貨號：M066），均購自北京索萊寶科技有限公司；IL-12（貨號：DY406-05）、TNF-α（貨號：DYDY419-05）、IFN-γ（貨號：DY421-05）、IL-17（貨號：DY410-05）ELISA 檢測試劑盒，均購自美國R&D 公司；RNA 提取液（貨號：G3013）、Servicebio?RT First Strand cDNA Synthesis Kit（貨號：G3330）、2×SYBR Green qPCR Master Mix（貨號：G3320），均購自武漢賽維爾生物科技有限公司；異丙醇（貨號：80109218）、HyPure TMMolecular Biology Grade Water（貨號：SH3053802），美國HyClone 公司； TLR4、TNF-α引物，由北京擎科生物科技公司合成；Rho 蛋白激酶2（ROCKII）抗體，美國eBioscience 公司，批號：124024；磷酸化肌球蛋白磷酸酶（P-MYPT1）抗體，美國ENZO 公司，批號：E03110；核因子-κB/p65（NF-κB/p65）抗體，英國Abcam 公司，批號：ab124024；β 肌動蛋白（β-actin）抗體，美國Cell Signaling 公司，批號：4870S；HRP Goat anti-rabbit IgG，上?？禐獒t(yī)療科技發(fā)展有限公司，批號：01334/10412。

1.3 主要儀器 PowerPacTM型電泳儀、PowerPacTM型半干轉(zhuǎn)膜儀、HOOD-Ⅱ型凝膠成像分析儀、CFX96型實(shí)時熒光定量PCR 儀器，美國Bio-Rad 公司；CM1950 型冰凍切片機(jī)、DM2000 型熒光顯微鏡，德國Leica 公司；NanoDrop2000 型超微量分光光度計(jì)，美國Thermo Fisher 公司；SpectraMax Plus 384 型酶標(biāo)儀，美國Molecular Devices 公司。

1.4 模型復(fù)制 用生理鹽水溶解MOG35-55配成水劑，用完全弗氏佐劑將結(jié)核分枝桿菌配成油劑，使用針管混合器把油劑與水劑按1∶1 充分混合，制成油包水樣抗原乳劑，靜置后無分層視為合格。于小鼠背部第4～5 節(jié)脊椎兩側(cè)選4 個點(diǎn)，皮下注射抗原乳劑（每只0.1 mL，MOG35-55含量為250 μg，結(jié)核分枝桿菌含量為350 μg）；免疫當(dāng)日和48 h 后，各組小鼠分別腹腔注射百日咳毒素（每只每次300 ng）。以小鼠尾張力下降為EAE 發(fā)病起始。

1.5 分組及給藥[8]將36 只C57BL/6 小鼠隨機(jī)分為正常組、模型組及五子衍宗方組（五子衍宗方免煎顆粒，16 g·kg-1·d-1），每組12 只。從免疫后第3 天開始灌胃（0.05 mL·g-1·d-1）給藥，每天2 次，早晚間隔12 h，持續(xù)干預(yù)25 d；正常組和模型組小鼠給予等體積生理鹽水（0.5 mL）灌胃。

1.6 神經(jīng)功能評分 從免疫當(dāng)天起，參考國際通用的5 分制評分[10]，每日對各組小鼠進(jìn)行神經(jīng)功能評分。0 分：無癥狀；1 分：尾張力消失，輕度步態(tài)笨拙；2 分：單側(cè)后肢無力，輔助翻身后恢復(fù)；3 分：雙側(cè)后肢均癱瘓無力，刺激后可稍有挪動；4 分：雙側(cè)后肢均癱瘓并伴有前肢單側(cè)或雙側(cè)癱瘓；5 分：動物處于瀕死或死亡狀態(tài)。如癥狀介于兩者之間的以±0.5 分計(jì)。

1.7 樣品采集與處理 脾細(xì)胞懸液制備：實(shí)驗(yàn)第28 天，小鼠麻醉后在無菌條件下摘取完整脾臟，迅速置于高糖培養(yǎng)基（滅菌）中低溫保存。隨后于無菌操作臺上，用注射器的無菌注射芯在0.7 μm 濾皿中將脾臟完全、充分研磨，剔除白色筋膜；加入1 mL 高糖培養(yǎng)基，連同脾細(xì)胞一起全部移入無菌離心管中；用臺盼藍(lán)染液對脾細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。

脊髓組織冰凍切片制備：取出脾臟后，通過心臟灌注生理鹽水至肝臟發(fā)白，然后推注4%多聚甲醛溶液灌流進(jìn)行體內(nèi)組織固定。分離脊髓，以O(shè)CT 包埋，在液氮中冷凍，用冰凍切片機(jī)制備厚度10 μm的脊髓冰凍切片。

1.8 HE 染色法檢測脊髓炎性細(xì)胞浸潤情況 取脊髓組織冰凍切片于水中浸泡2 min，蘇木素染色5 min；快速水洗后，于0.5%鹽酸乙醇分化5～15 s；快速水洗，伊紅染色2 min；快速水洗，依次經(jīng)70%、80%、90%、95%、100%乙醇梯度脫水；二甲苯透明，中性樹膠封片，光鏡下觀察并分析脊髓白質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤面積占整個脊髓面積的比值。

1.9 LFB 染色法檢測脊髓髓鞘脫失情況 取脊髓組織冰凍切片于95%乙醇中浸泡15 min 固定，然后浸入固藍(lán)溶液中，60 ℃烤箱孵育過夜。次日取出切片，在95%乙醇溶液和去離子水中分別浸洗10 min；然后在0.05%碳酸鋰溶液中快速浸洗10 s；于70%乙醇溶液中分化至肉眼能夠清晰分辨灰白質(zhì)；最后經(jīng)浸洗、梯度乙醇脫水、二甲苯透明及中性樹膠封片后，于光鏡下觀察并分析脊髓白質(zhì)區(qū)髓鞘脫失面積占整個脊髓面積的比值。

1.10 ELISA 法檢測小鼠脾細(xì)胞上清液中炎性因子水平 將各組小鼠脾細(xì)胞混懸液在常溫下以1 500 r·min-1（離心半徑8 cm）離心5 min，棄上清；移入10 mL 滅菌離心管中，PBS 沖洗后，以2 000 r·min-1（離心半徑8 cm）離心10 min，棄上清；加入20 mL 含MOG的高糖培養(yǎng)基，在5% CO2培養(yǎng)箱中孵育48 h 后，離心取上清液，保存?zhèn)溆?。?yán)格按照ELISA 試劑盒說明書步驟操作，分別檢測上清液中IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-12、IL-6 及IL-1β 含量。

1.11 qRT-PCR 法檢測小鼠脾細(xì)胞TLR4、TNF-α mRNA 表達(dá)情況 取各組脾細(xì)胞懸液，采用TRIzol試劑提取總RNA，以紫外分光光度法檢測總RNA 濃度及純度。采用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)制備cDNA，反應(yīng)條件：25 ℃、5 min，50 ℃、15 min，85 ℃、5 min，4 ℃、10 min。然后進(jìn)行熒光定量PCR 反應(yīng)，取0.2 mL PCR 管，配制PCR 反應(yīng)體系：7.5 μL 2×qPCR Mix、4.0 μL ddH2O、2.0 μL cDNA、正/反向引物各0.75 μL。PCR 擴(kuò)增反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性10 min，95 ℃下變性15 s，60 ℃下退火30 s，共循環(huán)40 次；擴(kuò)增循環(huán)結(jié)束后，降溫至65 ℃，每15 s 升溫0.3 ℃，升溫至95 ℃完成熔解。反應(yīng)結(jié)束后，計(jì)算Ct 值，以β-actin 為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算目的基因相對表達(dá)水平。各基因合成引物序列見表1。

1.12 Western Blot 法檢測小鼠脾臟ROCKII、P-MYPT1 及NF-κB 蛋白表達(dá)情況 4 ℃條件下，將小鼠脾臟組織加裂解液充分裂解，提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白含量。加Loading buffer 上樣緩沖液制備樣品，經(jīng)SDS-PAGE 電泳、轉(zhuǎn)膜后，用5%脫脂奶粉封閉1.5 h；洗滌后，分別加入一抗ROCKII、P-MYPT1、NF-κB 及β-actin 抗體，4 ℃下孵育過夜；次日洗膜后，加入相應(yīng)二抗，室溫下孵育2 h；洗滌后，以凝膠成像分析儀檢測蛋白條帶；采用Image Lab 3.0 軟件進(jìn)行灰度值比較，以β-actin 為內(nèi)參，對目的蛋白進(jìn)行半定量分析。

1.13 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理方法 采用GraphPad Prism 8.0 統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析；計(jì)量資料以均數(shù)± 標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示；多組間比較采用單因素方差分析（One-way ANOVA），兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn)，不滿足方差齊性則采用非參數(shù)檢驗(yàn)；以P＜0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 五子衍宗方免煎顆粒對EAE 小鼠神經(jīng)功能的影響 結(jié)果見圖1。與正常組比較，模型組小鼠在免疫后第10 天開始發(fā)病，平均起病時間為（11.20±1.10）d；小鼠開始出現(xiàn)精神萎靡不振、皮毛失澤不整，尾部及后肢肌力下降甚至出現(xiàn)癱瘓，平均最高神經(jīng)評分為（3.50±0.35）分，神經(jīng)功能評分顯著升高（P＜0.05，P＜0.01）。與模型組比較，五子衍宗方組小鼠在免疫后第14 天開始發(fā)病，平均起病時間為（15.00±1.00）d，起病時間明顯推遲（P＜0.05）；小鼠精神狀態(tài)及相關(guān)癥狀得到明顯改善，平均最高神經(jīng)評分為（2.50±0.35）分，神經(jīng)功能評分顯著降低（P＜0.05，P＜0.01）。

圖1 各組小鼠的神經(jīng)功能評分（±s，n=12）Figure 1 Neurological function score of mice in each group（±s，n=12）

2.2 五子衍宗方免煎顆粒對EAE 小鼠脊髓炎性細(xì)胞浸潤的影響 結(jié)果見圖2。正常組、模型組、五子衍宗方組小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)炎性細(xì)胞浸潤面積占整個脊髓面積的比值分別為（0.56±0.11）%、（6.16±0.75）%、（3.79±0.25）%。與正常組比較，模型組小鼠脊髓炎性細(xì)胞浸潤顯著增加（P＜0.001）；與模型組相比，五子衍宗方組小鼠脊髓炎性細(xì)胞浸潤顯著減少（P＜0.01）。

圖2 各組小鼠脊髓炎性細(xì)胞浸潤情況（HE 染色，×50，×200；±s，n=12）Figure 2 Infiltration of inflammatory cells in spinal cord of mice in each group（HE staining，×50，×200；±s，n=12）

2.3 五子衍宗方免煎顆粒對EAE 小鼠脊髓髓鞘脫失的影響 結(jié)果見圖3。正常組、模型組、五子衍宗方組小鼠脊髓白質(zhì)區(qū)髓鞘脫失面積占整個脊髓面積的比值分別為（1.77±0.58）%、（9.81±1.66）%、（4.12±0.67）%。與正常組比較，模型組小鼠髓鞘脫失顯著增加（P＜0.01）；與模型組相比，五子衍宗方組小鼠髓鞘脫失顯著減少（P＜0.01）。

圖3 各組小鼠脊髓髓鞘脫失情況（LFB 染色，×50，×200；±s，n=12）Figure 3 Demyelination of spinal cord in each group of mice（LFB staining，×50，×200；±s，n=12）

2.4 五子衍宗方免煎顆粒對EAE 小鼠脾細(xì)胞炎性因子表達(dá)水平的影響 結(jié)果見圖4、圖5。與正常組比較，模型組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-12、IL-6 及IL-1β 的表達(dá)水平顯著上升（P＜0.001）；與模型組比較，五子衍宗方組小鼠脾細(xì)胞IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-12、IL-6 及IL-1β 的表達(dá)水平顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）。

圖4 各組小鼠脾細(xì)胞炎性因子IFN-γ、TNF-α、IL-17 及IL-12 的表達(dá)情況（±s，n=6）Figure 4 Expressions of inflammatory factors IFN-γ，TNF-α，IL-17 and IL-12 in splenocyte of mice in each group（±s，n=6）

圖5 各組小鼠脾細(xì)胞炎性因子IL-6、IL-1β 的表達(dá)情況（±s，n=6）Figure 5 Expressions of inflammatory factors IL-6 and IL-1β in splenocyte of mice in each group（±s，n=6）

2.5 五子衍宗方免煎顆粒對EAE 小鼠脾細(xì)胞TLR4、TNF-α mRNA 表達(dá)的影響 結(jié)果見圖6。與正常組比較，模型組小鼠脾細(xì)胞TLR4、TNF-α mRNA 表達(dá)水平均顯著上升（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，五子衍宗方組小鼠脾細(xì)胞TLR4、TNF-α mRNA表達(dá)水平均顯著降低（P＜0.01，P＜0.001）。

圖6 各組小鼠脾細(xì)胞TLR4、TNF-α mRNA 表達(dá)情況（±s，n=3）Figure 6 The mRNA expressions of TLR4 and TNF- α in splenocyte of mice in each group（±s，n=3）

2.6 五子衍宗方免煎顆粒對EAE 小鼠脾臟組織ROCKII、P-MYPT1、NF-κB 蛋白表達(dá)的影響 結(jié)果見圖7。與正常組比較，模型組小鼠脾臟ROCKII、P-MYPT1、NF-κB 蛋白表達(dá)量顯著升高（P＜0.01，P＜0.001）；與模型組比較，五子衍宗方組小鼠脾臟ROCKII、P-MYPT1、NF-κB 蛋白表達(dá)量均顯著降低（P＜0.01）。

圖7 各組小鼠脾臟組織ROCKII、P-MYPT1、NF-κB 蛋白表達(dá)情況（±s，n=3）Figure 7 The protein expressions of ROCKII，P-MYPT1 and NF-κB in splenic of mice in each group（±s，n=3）

3 討論

多發(fā)性硬化（MS）因病變累及部位的空間多發(fā)性而導(dǎo)致臨床癥狀廣泛，主要表現(xiàn)為肢體麻木無力、肌力減退、共濟(jì)失調(diào)、自主神經(jīng)功能紊亂及精神障礙等[11]。中醫(yī)將MS 歸屬為“痿證”“痹證”范疇，認(rèn)為病位在“腦與髓”，“腎虛”是本病的根本病因，五子衍宗方具有補(bǔ)腎益精之功效[12]，可用于本病的治療。本研究表明，五子衍宗方免煎顆粒能夠明顯延長EAE 小鼠的發(fā)病時間，降低神經(jīng)功能評分，顯示出治療效果。此外，MS 的病理表現(xiàn)無論在急性期還是緩解期均有廣泛的白質(zhì)炎性脫髓鞘[13]。其病灶部位不僅局限于白質(zhì)區(qū)域，皮層也有受累，隨疾病進(jìn)程，炎性細(xì)胞浸潤和髓鞘脫失持續(xù)惡化[14]。本研究通過病理學(xué)觀察表明，EAE 模型組小鼠脊髓呈現(xiàn)大量炎性細(xì)胞浸潤和脫髓鞘現(xiàn)象，五子衍宗方免煎顆粒干預(yù)后，脊髓白質(zhì)炎性細(xì)胞浸潤及脫髓鞘程度顯著減輕。由此可見，五子衍宗方免煎顆粒治療可明顯緩解EAE 小鼠的臨床神經(jīng)功能癥狀，減輕脊髓炎性病變及髓鞘脫失，具有神經(jīng)保護(hù)作用。

MS 是主要由CD4+Th1 細(xì)胞介導(dǎo)的炎性脫髓鞘疾病，Th 細(xì)胞分化促進(jìn)炎性因子釋放，機(jī)體產(chǎn)生炎性病變[15]。IL-17 是一種高度致炎細(xì)胞因子，能啟動和刺激炎性細(xì)胞產(chǎn)生；IFN-γ 是EAE 發(fā)病的關(guān)鍵致病因子，可釋放TNF-α 等介質(zhì)并引起脫髓鞘；TNF-α、IL-6 及IL-1β 能刺激巨噬細(xì)胞釋放炎性介質(zhì)；IL-12 在Th1 細(xì)胞分化中起重要作用，抑制IL-12 可調(diào)控Th1 細(xì)胞分化，減輕EAE 的病理變化[16]。研究[17]證實(shí)，MS 患者血清和腦脊液中炎性因子水平的升高與臨床發(fā)病進(jìn)程密切相關(guān)。TLR4 是Toll 樣受體家族成員，分布廣泛，表達(dá)于中樞神經(jīng)系統(tǒng)多種細(xì)胞中[18]。研究[19]證明，TLR4 在炎性反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，可通過啟動相應(yīng)的炎性反應(yīng)參與識別和清除病原微生物。TLR4 介導(dǎo)的神經(jīng)炎性反應(yīng)參與了MS 的發(fā)生發(fā)展[20]，激活TLR4 會產(chǎn)生高水平的促炎因子，造成髓鞘損傷[21]。在MS 患者和EAE 小鼠的脊髓中，TLR4 表達(dá)水平均明顯升高，而抑制TLR4 表達(dá)對延緩EAE 的發(fā)生有一定作用[22]。因此，減輕炎性反應(yīng)是緩解和治療MS 的重要策略。本研究結(jié)果顯示，EAE 小鼠脾細(xì)胞的IFN-γ、TNF-α、IL-17、IL-12、IL-6 及IL-1β 水平均顯著升高，TLR4 基因表達(dá)亦顯著上調(diào)，提示小鼠體內(nèi)存在嚴(yán)重炎性反應(yīng)；而五子衍宗方免煎顆粒干預(yù)后，炎性因子及炎性受體的表達(dá)水平均顯著下調(diào)。

MS 的病理改變與Rho/ROCK 信號通路的激活有關(guān)[23]。在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中，Rho/ROCK 信號通路激活后，可進(jìn)一步激活效應(yīng)底物ROCKII，刺激效應(yīng)分子P-MYPT1 產(chǎn)生，促進(jìn)炎性反應(yīng)[24]。Rho 激酶抑制劑可下調(diào)NF-κB 表達(dá)，減輕炎性反應(yīng)，減少炎性細(xì)胞浸潤，促進(jìn)髓鞘再生[25]。本研究結(jié)果顯示，五子衍宗方免煎顆?？梢种艵AE 小鼠脾臟組織NF-κB、ROCKII 及P-MYPT1 蛋白表達(dá)，提示其可能通過抑制Rho 及NF-κB 信號通路的激活來抑制炎性反應(yīng)。

綜上所述，五子衍宗方免煎顆粒能夠改善EAE小鼠的神經(jīng)功能，減少炎癥浸潤及脫髓鞘等病理損害，具有神經(jīng)保護(hù)作用，其作用機(jī)制可能與抑制Rho及NF-κB 信號通路，降低相關(guān)炎性因子水平有關(guān)。