長柄唐松草化學(xué)成分及對MHCC97細胞增殖的影響

羅順，唐素勤

（1.河南中醫(yī)藥大學(xué)第三附屬醫(yī)院，河南 鄭州 450001；2.河南省中醫(yī)藥研究院，河南 鄭州 450004）

長柄唐松草（Thalictrum przewalskiiMaxim.）是毛茛科唐松草屬草本植物［1］。廣泛分布于河南、安徽、湖北、陜西、山西等地，主要化學(xué)成分為黃酮類、生物堿、有機酸類、蒽醌類等［2］，具有燥濕利水、化瘀通絡(luò)的功效。李向日［3］研究發(fā)現(xiàn)長柄唐松草可治療肝炎、肝硬化。劉冉等［4］從長柄唐松草中分離得到13 個化合物，并測試化合物的體外抗腫瘤活性，結(jié)果顯示化合物pleuchiol、diasyringaresinol具有抑制肝癌細胞株增殖的作用，emodin bianthrones A 具有抑制胃癌細胞株增殖的作用，libanoridin具有抑制胃癌、結(jié)腸癌、肝癌細胞株增殖的作用。筆者對長柄唐松草進一步分離、鑒定出11 個化合物，分別為5，3′ －dihydroxy－7，4′－dimethoxyflavanone（1）、crototropone（2）、columbianetin acetate（3）、isopropylidenkirenol（4）、isosilychristin（5）、9α－羥基紫菀內(nèi)酯（6）、對羥基肉桂酸甲酯（7）、dehydroespeleton（8）、piceatannol 4′－O－（6″－Ogalloyl）－β－D－glucopyranoside（9）、isolugrandoside（10）和對甲氧基肉桂酸（11）。所有化合物均為首次從長柄唐松草中分離得到，其中化合物3 和化合物8 對MHCC97細胞具有一定的抑制作用。

1 儀器與材料

Flexar SQ 300 型質(zhì)譜儀（美國Perkin elmer 公司）；Bruker ARX 600 型核磁共振波譜儀（瑞士Bruker 公司）；XFGL152 型電子天平（德國Sigma 公司）；FPLM 1926 型超聲波清洗器（德國Eppendorf 公司）；YGH700型全自動轉(zhuǎn)子離心機（鄭州長城科工貿(mào)有限公司）；柱色譜硅膠、薄層硅膠板（青島海洋化工廠）；SephadeX LH－20（美國Pharmacia 公司）；人肝癌細胞株（MHCC97，中科院上海生命科學(xué)研究院）；噻唑藍（MTT，上海源葉生物科技有限公司）；5－氟尿嘧啶（長春長慶藥業(yè)集團有限公司）；二甲基亞砜（DMSO，上海生物科技有限公司）。所用試劑純度均為分析純。

長柄唐松草采自河南省鄭州市，經(jīng)河南中醫(yī)藥研究院王治陽副主任藥師鑒定為長柄唐松草（Thalictrum przewalskiiMaxim.）。

2 提取與分離

取干燥的長柄唐松草17.2 kg，加入6 倍體積的95%乙醇溶液回流提取3 次，每次2 h。合并3 次提取液，減壓濃縮后，得長柄唐松草浸膏1.8 kg。取1.5 kg浸膏超聲溶解于水中，依次用等體積的石油醚、二氯甲烷、乙酸乙酯和正丁醇萃取，經(jīng)減壓濃縮，得石油醚層浸膏（Fr.A，164.2 g）、二氯甲烷層浸膏（Fr.B，136.5 g）、丙酮層浸膏（Fr.C，96.2 g）和正丁醇層浸膏（Fr.D，142.3 g）。

取Fr.B，經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－丙酮－甲醇（80∶20∶0→40∶60∶0→0∶80∶20）進行梯度洗脫，得到8個流分（Fr.B 1～8）。

Fr.B 3（8.1 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇（70∶30∶0→30∶70∶0→0∶80∶20）進行梯度洗脫，得到7 個組分Fr.B 3－1～Fr.B 3－7。Fr.B 3－2（0.8 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－丙酮（55∶45）洗脫，得化合物3（24 mg）和化合物5（21 mg）；Fr.B 3－4（0.4 g）經(jīng)Sephadex LH－20 色譜柱，以甲醇洗脫，得化合物1（17 mg）；Fr.B 3－6（0.9 g）經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶，得化合物9（22 mg）。

Fr.B 5（9.3 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－丙酮－甲醇（70∶30∶0→30∶70∶0→0∶70∶30）梯度洗脫，得到6 個組分Fr.B 5－1～Fr.B 5－6。Fr.B 5－2（0.4 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇（60∶30∶10）洗脫，得化合物2（21 mg）和化合物8（19 mg）；Fr.B 5－4（0.5 g）經(jīng)Sephadex LH－20 色譜柱，以甲醇洗脫，得化合物4（22 mg）。

取Fr.C，經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇（70∶30∶0→30∶70∶0→0∶70∶30）梯度洗脫，得到7個流分（Fr.C 1～7）。

Fr.C 2（9.4 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－丙酮－甲醇（60∶40∶0→20∶80∶0→0∶70∶30）梯度洗脫，得到6 個組分Fr.C 2－1～Fr.C 2－6。Fr.C 2－3（0.7 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－乙酸乙酯（45∶55）洗脫，得化合物6（18 mg）；Fr.C 2－5（0.5 g）經(jīng)結(jié)晶、重結(jié)晶，得化合物11（25 mg）。

Fr.C 4（7.8 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇（60∶40∶0→20∶80∶0→0∶60∶40）梯度洗脫，得到6 個組分Fr.C 4－1～Fr.C 4－6。Fr.C 4－2（0.3 g）經(jīng)硅膠色譜柱，以石油醚－乙酸乙酯－甲醇（50∶30∶20）洗脫，得化合物10（27 mg）；Fr.C 4－4（0.6 g）經(jīng)Sephadex LH－20 色譜柱，以甲醇洗脫，得化合物7（24 mg）。

3 結(jié)果鑒定

3.1 化合物1

黃色粉末（丙酮）。分子式為C17H16O6，ESI－MS m/z：339.1［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：13.02（1H，s，5－OH），7.14（1H，d，J = 9.6 Hz，H－2′），7.02（1H，d，J =9.6 Hz，H－5′），6.93（1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H－6′），6.15（1H，d，J=9.6 Hz，H－8），5.92（1H，d，J=9.6 Hz，H－6），5.72（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－2），4.13（3H，s，7－OCH3），3.81（3H，s，4′－OCH3），3.35（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－3a），2.81（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－3b）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：113.7（C－1），79.6（C－2），45.3（C－3），204.7（C－4），161.2（C－5），95.8（C－6），170.4（C－7），94.6（C－8），158.4（C－9），103.1（C－10），128.6（C－1′），117.5（C－2′），145.1（C－3′），148.2（C－4′），112.7（C－5′），118.2（C－6′），57.1（7－OCH3），56.3（4′－OCH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［5］中5，3′－dihydroxy－7，4′－dimethoxy flavanone數(shù)值基本一致。

3.2 化合物2

白色晶體（甲醇）。分子式為C10H12O4，ESI－MS m/z：219.1［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：14.03（1H，s，3－OH），6.12（1H，d，J = 9.6 Hz，H－4），5.52（1H，d，J =9.6 Hz，H－7），4.03（3H，s，6－OCH3），3.82（3H，s，5－OCH3），2.63（3H，s，2－OCH3）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：201.3（C－1），106.2（C－2），169.1（C－3），93.7（C－4），166.3（C－5），161.7（C－6），90.8（C－7），33.4（2－OCH3），55.7（5－OCH3），55.7（6－OCH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［6］中crototropone數(shù)值基本一致。

3.3 化合物3

白色粉末（丙酮），分子式為C16H16O5，ESI－MS m/z：311.2［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.68（1H，d，J =9.6 Hz，H－4），7.08（1H，d，J = 9.6 Hz，H－5），6.72（1H，d，J=9.6 Hz，H－6），6.25（1H，d，J=9.6 Hz，H－3），5.13（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－2′），3.53（1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H－3′），3.34（1H，dd，J=9.6，6.3 Hz，H－3′），1.96（3H，s，H－4″），1.54（3H，s，1″－CH3），1.38（3H，s，1″－CH3）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：131.7（C－1），156.4（C－2），115.8（C－3），148.2（C－4），123.7（C－5），106.8（C－6），166.2（C－7），113.6（C－8），150.1（C－9），115.3（C－10），108.2（C－1′），91.2（C－2′），30.2（C－3′），84.1（C－1″），169.1（C－3″），24.8（C－4″），25.1（1″－CH3），22.0（4″－CH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［7］中columbianetin acetate 數(shù)值基本一致。

3.4 化合物4

白色粉末（甲醇）。分子式為C23H21O5，ESI－MS m/z：400.4［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.32（1H，s，H－14），4.05（1H，t，J = 9.6 Hz，H－15），3.92（1H，t，J =9.6 Hz，H－16a），3.74（1H，m，H－2），3.64（1H，t，J =9.6 Hz，H－16b），3.58（1H，d，J = 9.6 Hz，H－19a），3.22（1H，d，J = 9.6 Hz，H－19b），1.42（3H，s，H－22），1.31（3H，s，H－23），1.13（3H，s，H－18），0.92（3H，s，H－17），0.76（3H，s，H－20）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：49.1（C－1），64.8（C－2），43.7（C－3），40.1（C－4），54.5（C－5），21.8（C－6），35.8（C－7），137.3（C－8），48.3（C－9），42.4（C－10），19.7（C－11），32.8（C－12），36.2（C－13），128.2（C－14），80.3（C－15），64.1（C－16），23.7（C－17），26.2（C－18），65.2（C－19），18.1（C－20），108.5（C－21），25.8（C－22），24.7（C－23）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［8］中isopropylidenkirenol 數(shù)值基本一致。

3.5 化合物5

黃色粉末（甲醇）。分子式為C25H22O10，ESI－MS m/z：504.8［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.25（1H，brs，H－6′），7.03（1H，s，H－2″），6.77（1H，brs，H－6″），6.47（1H，brs，H－5′），6.26（1H，d，J=9.6 Hz，H－5″），5.64（1H，brs，H－6），5.51（1H，brs，H－8），5.32（1H，brs，H－a），4.75（1H，d，J=9.6 Hz，H－2），4.17（1H，d，J=9.6 Hz，H－3），3.75（1H，m，H－γ），3.61（3H，s，3″－OCH3），3.51（1H，brs，H－β），3.42（1H，brs，H－β）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：105.2（C－1），79.2（C－2），72.8（C－3），200.3（C－4），149.2（C－5），100.4（C－6），148.1（C－7），95.2（C－8），156.1（C－9），99.7（C－10），124.1（C－1′），115.3（C－2′），140.2（C－3′），136.8（C－4′），113.2（C－5′），99.2（C－6′），143.6（C－1″），105.4（C－2″），149.0（C－3″），145.3（C－4″），113.6（C－5″），120.4（C－6″），80.4（C－α），49.7（C－β），60.4（C－γ），56.3（3″－OCH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［9］中isosilychristin數(shù)值基本一致。

3.6 化合物6

白色粉末（甲醇）。分子式為C15H20O3，ESI－MS m/z：271.3［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：5.17（1H，dt，J =9.6，6.3 Hz，H－9），5.03（1H，q，J=9.6 Hz，H－15α），4.72（1H，q，J = 9.6 Hz，H－15β），4.03（1H，d，J =9.6 Hz，H－8），3.48（3H，s，H－13），2.47～2.41（1H，m，H－3α），2.32～2.28（2H，m，H－2β，6β），2.68（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－6α），2.24（1H，dt，J =9.6，6.3 Hz，H－5），2.02（1H，dt，J= 9.6，6.3 Hz，H－2α），1.81（1H，ddq，J=9.6，6.3，2.2 Hz，H－1α），1.73～1.61（1H，m，H－2β），1.41（1H，dp，J = 9.6，6.3 Hz，H－1β），1.02（3H，d，J=6.3 Hz，H－14）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：40.5（C－1），21.7（C－2），35.8（C－3），150.2（C－4），41.7（C－5），27.3（C－6），160.4（C－7），80.2（C－8），76.1（C－9），36.3（C－10），122.3（C－11），181.3（C－12），76.4（C－13），94.2（C－14），106.1（C－15）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［10］中9α－羥基紫菀內(nèi)酯數(shù)值基本一致。

3.7 化合物7

黃色粉末（丙酮）。分子式為C10H10O3，ESI－MS m/z：201.2［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.61（1H，d，J =9.6 Hz，H－7），7.42（2H，d，J=9.6 Hz，H－2，6），6.72（2H，d，J = 9.6 Hz，H－3，5），6.25（1H，d，J = 9.6 Hz，H－8），3.91（3H，s，9－OCH3）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：131.2（C－1），126.2（C－2），118.1（C－3），162.8（C－4），116.1（C－5），130.3（C－6），145.1（C－7），115.2（C－8），166.7（C－9），52.6（9－OCH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［11］中對羥基肉桂酸甲酯數(shù)值基本一致。

3.8 化合物8

白色粉末（甲醇）。分子式為C14H16O3，ESI－MS m/z：255.1［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：8.35（1H，d，J =6.3 Hz，H－6），7.82（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－4），7.09（1H，d，J = 9.6 Hz，H－3），6.62（1H，s，H－8），4.12（3H，s，2－OCH3），2.61（3H，s，H－2′），2.28（3H，s，H－10），2.05（3H，s，H－11）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：156.4（C－1），130.4（C－2），124.7（C－3），136.1（C－4），130.8（C－5），132.8（C－6），196.2（C－7），108.4（C－8），162.7（C－9），30.4（C－10），25.7（C－11），192.4（C－1′），20.6（C－2′），56.3（3′－OCH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［12］基本一致，故鑒定為dehydroespeleton。

3.9 化合物9

棕色粉末（丙酮）。分子式為C27H26O13，ESI－MS m/z：581.2［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.12（2H，s，H－2′，6′），7.04（1H，d，J = 9.6 Hz，H－5′），6.91（1H，d，J =6.3 Hz，H－2′），6.83（1H，d，J = 9.6 Hz，H－8），6.71（1H，d，J = 9.6 Hz，H－7），6.54（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－6′），6.42（1H，d，J = 9.6 Hz，H－2），6.35（2H，d，J=9.6 Hz，H－6），5.94（1H，t，J=9.6 Hz，H－4），4.81（1H，d，J = 6.3 Hz，H－1″），4.48（1H，dd，J =9.6，6.3 Hz，H－6″a），4.42（1H，dd，J = 9.6，6.3 Hz，H－6″b），3.72（1H，m，H－5″），3.51（1H，m，H－2″），3.43（1H，m，H－3″），3.29（1H，m，H－4″）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：139.4（C－1），105.8（C－2），160.2（C－3），103.1（C－4），160.4（C－5），105.3（C－6），127.5（C－7），130.2（C－8），133.7（C－1′），115.1（C－2′），147.4（C－3′），145.7（C－4′），119.2（C－5′），120.4（C－6′），104.1（C－1″），75.2（C－2″），78.3（C－3″），71.9（C－4″），76.3（C－5″），65.1（C－6″），120.6（C－1′），109.4（C－2′），147.2（C－3′），139.5（C－4′），147.1（C－5′），109.4（C－6′），167.5（C－7′）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［13］基本一致，故鑒定為piceatannol 4′－O－（6″－O－galloyl）－β－D－glucopyranoside。

3.10 化合物10

白色粉末（丙酮），分子式為C21H20O12，ESI－MS m/z：487.1［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.49（1H，d，J =9.6 Hz，H－7′），7.09（1H，brs，H－2′），6.84（1H，d，J= 9.6 Hz，H－6′），6.65（1H，d，J= 9.6 Hz，H－5′），6.48（2H，brs，H－2，5），6.36（1H，dd，J =9.6，6.3 Hz，H－6），6.18（1H，d，J = 9.6 Hz，H－8′），4.19（1H，d，J =9.6 Hz，H－1′），3.94（1H，d，J = 9.6 Hz，H－1″），2.83（2H，m，H－7）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：130.7（C－1），116.8（C－2），145.7（C－3），146.2（C－4），116.2（C－5），120.3（C－6），35.2（C－7），70.3（C－8），103.5（C－1′），71.8（C－2′），78.2（C－3′），67.6（C－4′），75.8（C－5′），69.1（C－6′），105.2（C－1″），74.2（C－2″），77.2（C－3″），70.3（C－4″），77.2（C－5″），59.4（C－6″），126.2（C－1′），117.3（C－2′），145.9（C－3′），150.3（C－4′），116.9（C－5′），121.5（C－6′），144.8（C－7′），113.4（C－8′），166.2（C－9′）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［14］基本一致，故鑒定為isolugrandoside。

3.11 化合物11

褐色粉末（丙酮），分子式為C10H10O3，ESI－MS m/z：201.3［M+Na］+。

1H－NMR（600 MHz，CD3OD）δ：7.71（1H，d，J =9.6 Hz，H－7），7.53（2H，d，J=6.3 Hz，H－2，6），6.75（2H，d，J = 6.3 Hz，H－3，5），6.25（1H，d，J = 9.6 Hz，H－8），3.81（3H，s，10－OCH3）。

13C－NMR（150 MHz，CD3OD）δ：126.2（C－1），130.1（C－2），117.2（C－3），159.3（C－4），117.2（C－5），130.1（C－6），147.2（C－7），115.2（C－8），170.2（C－9），151.4（10－OCH3）。

以上數(shù)據(jù)與文獻［15］基本一致，故鑒定為對甲氧基肉桂酸。

4 對MHCC97細胞增殖活性的影響

采用MTT 法［16］測試化合物（2～5、8、10）體外對人肝癌細胞株MHCC97增殖活性的影響。取對數(shù)生長期的MHCC97細胞2 mg，經(jīng)胰蛋白酶處理后，稀釋至密度為6×104個/mL，接種于96孔板中，每孔取100 μL。在CO2恒溫培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h。以5－氟尿嘧啶作為對照組，分別加入5－氟尿嘧啶和化合物（濃度分別為0.1、1、5、10、50 μg/mL），培養(yǎng)48 h后，在避光條件下每孔分別加入10 μL MTT 溶液染色，培養(yǎng)4 h，取上清液，每孔分別加入100 μL DMSO，搖晃5 min。采用酶標儀在520 nm 波長下測定吸光度，計算MHCC97 的抑制率及IC50值。結(jié)果顯示化合物3的IC50值為11.26 μg/mL，化合物8的IC50值為28.43 μg/mL。見表1。

表1 化合物對MHCC97細胞的體外抑制作用

5 討論

本研究從長柄唐松草中共分離得到11 個化合物，所有化合物均為首次從長柄唐松草中分離得到，其中化合物2、3、5、6、8、10 為首次從該屬植物中分離得到。研究還發(fā)現(xiàn)，化合物3、8 對MHCC97 細胞具有一定的抑制作用，其中化合物3 對MHCC97 細胞的抑制作用與5－氟尿嘧啶比較無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05），其他化合物對MHCC97細胞則無明顯抑制作用。本研究豐富了長柄唐松草的化學(xué)成分的資料庫，為抑制細胞增殖的新藥研發(fā)提供了一定的幫助。