生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物合成及其抗腫瘤活性研究

許娜，彭婷，羅志勇，鄒自征，馬大友，劉蘇友，劉麗君*（.中南大學(xué)湘雅藥學(xué)院，長(zhǎng)沙4003；.中南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，長(zhǎng)沙 4003）

天然產(chǎn)物及其衍生物是發(fā)現(xiàn)新藥的重要來源[1]，很多天然產(chǎn)物具有良好的抗腫瘤活性，可以直接作為抗腫瘤藥物或先導(dǎo)化合物。多殺菌素（spinosyn） 是刺糖多胞菌Saccharopolys poraspinosa發(fā)酵液中提取的大環(huán)內(nèi)酯類化合物。它是一種新型的生物源廣譜綠色低毒殺蟲劑，于20世紀(jì)90年代初期開發(fā)并推向市場(chǎng)[2]。研究顯示，多殺菌素還能夠抑制細(xì)菌和病毒感染，促進(jìn)傷口愈合，同時(shí)對(duì)多種腫瘤細(xì)胞有抑制活性[3]。多殺菌素A（spinosyn A，見圖1）是其主要成分，它不僅生物活性高，而且對(duì)非靶標(biāo)生物的毒性很低[4]。多殺菌素在抗腫瘤藥物研究領(lǐng)域結(jié)構(gòu)新穎，但是其抗腫瘤作用機(jī)制仍不明確，值得進(jìn)一步研究。

小分子探針是確定活性化合物生物靶點(diǎn)的重要工具，其中生物素標(biāo)記探針是發(fā)現(xiàn)活性天然產(chǎn)物靶點(diǎn)蛋白的有效手段[5-8]。生物素標(biāo)記探針主要由三部分組成，分別是生物素、連接基團(tuán)和活性基團(tuán)[9]。連接基團(tuán)是將活性基團(tuán)和生物素連接起來的長(zhǎng)鏈或短鏈結(jié)構(gòu)，它的結(jié)構(gòu)會(huì)影響到探針的生物活性和穩(wěn)定性[10]。連接基團(tuán)的主要功能是調(diào)節(jié)生物素和活性基團(tuán)的空間距離，避免生物素和活性基團(tuán)的空間干擾。常用的連接基團(tuán)有長(zhǎng)鏈脂肪烷烴[11]、多肽片段[12]或乙二醇[13]等。

為了研究多殺菌素衍生物的抗腫瘤作用機(jī)制，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)并合成帶有生物素標(biāo)記的多殺菌素衍生物，來研究其體外抗腫瘤活性。

1 材料

D-生物素（上海瑞永生物科技有限公司，純度≥99%）；氯乙酰氯、1，3-二溴丙烷、1，6-二溴己烷（薩恩化學(xué)技術(shù)有限公司，純度均為98%）；其他試劑均為市售分析純或化學(xué)純。Bruker DRX型核磁共振儀（400 MHz，500 MHz）；X-4 型數(shù)字顯微熔點(diǎn)儀；安捷倫6200/6500 series Q-TOF MS（HR-ESI-MS）型質(zhì)譜儀。多殺菌素A 按文獻(xiàn)方法由多殺菌素甲醇重結(jié)晶得到，純度大于95%[14]。

2 方法與結(jié)果

本研究在多殺菌素A 的福樂糖胺氮原子上引入含有不同連接基團(tuán)的生物素，合成生物素標(biāo)記的多殺菌素衍生物（見圖1），并測(cè)試它們的體外抗腫瘤活性，研究不同連接基團(tuán)對(duì)生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物抗腫瘤活性的影響。

圖1 生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物的設(shè)計(jì)Fig 1 Design of biotin-labeled spinosyn compounds

2.1 生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物的合成

化合物2 的合成路線如圖2所示[15]，多殺菌素A 福樂糖胺氮原子發(fā)生脫甲基反應(yīng)得到多殺菌素B。多殺菌素B 在弱堿條件下和氯乙酰氯發(fā)生乙?；磻?yīng)得到中間體1，最后中間體1 和生物素通過親核反應(yīng)得到生物素標(biāo)記的化合物2。

圖2 化合物2 的合成路線Fig 2 Synthetic route for compound 2

化合物5、6 和7 的合成路線如圖3所示，多殺菌素B 在弱堿條件下，與1，3-二溴丙烷或1，6-二溴己烷發(fā)生親核取代反應(yīng)，分別得到中間體3 或4。3 或4 以二甲基酰胺（DMF）為溶劑，在弱堿條件下與生物素發(fā)生酯化反應(yīng)得到生物素標(biāo)記的化合物5 或6。在乙腈溶劑中，化合物6和碘甲烷發(fā)生N-甲基化反應(yīng)，得到生物素標(biāo)記的季銨鹽化合物7。

圖3 化合物5、6 和7 的合成路線Fig 3 Synthetic route for compound 5，6 and 7

2.2 結(jié)構(gòu)鑒定

2.2.1N-（3-氯乙?；┒鄽⒕兀?）的合成

向50 mL 單口圓底燒瓶中，加入多殺菌素B 300 mg（0.42 mmol）、二氯甲烷20 mL 和三乙胺59 μL（0.42 mmol），最后加入氯乙酰氯 94 μL（1.26 mmol），回流攪拌2 h，抽濾，用二氯甲烷（3×20 mL）和水15 mL 萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。除去溶劑后，經(jīng)硅膠柱層析[V（乙酸乙酯）∶V（石油醚）＝4∶1]純化，得淡黃色固體173 mg， 產(chǎn)率52%。mp.103～106℃；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.77（s，1H），5.90～5.85（m，1H），5.82～5.77（m，1H），4.85（s，1H），4.70～4.63（m，1H），4.53～4.46（m，1H），4.34～4.28（m，1H），4.17～4.13（m，1H），4.10～4.03（m，2H），3.71～3.61（m，2H），3.57～3.53（m，4H），3.52～3.43（m，8H），3.43～3.37（m，1H），3.33～3.26（m，1H），3.14～3.08（m，2H），3.04～2.98（m，1H），2.95（s，1H），2.90～2.83（m，1H），2.81～2.77（m，1H），2.43～2.37（m，1H），2.29～2.22（m，1H），2.20～2.12（m，1H），2.06～2.01（m，1H），1.97～1.89（m，2H），1.80～1.71（m，2H），1.59～1.41（m，7H），1.38～1.30（m，2H），1.29～1.25（m，3H），1.22～1.12（m，7H），0.95～0.84（m，2H），0.84～0.78（m，3H）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：202.6，172.3，167.0，147.6，144.0，129.3，128.7，103.1，95.4，82.2，81.0，80.5，76.7，76.5，76.0，71.8，67.8，60.8，59.2，58.9，57.6，49.4，47.5，46.0，41.7，41.4，41.1，37.3，36.2，34.1，30.7，30.0，28.3，28.0，26.1，21.5，18.1，17.7，16.0，9.3；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C42H64ClNO11[M ＋H]＋）：816.4065，實(shí)測(cè)值：816.4083。

2.2.2 多殺菌素-乙?；?生物素（2）的合成向50 mL 單口圓底燒瓶中加入DMF 1.5 mL、化合物1 100 mg（0.13 mmol）和D-生物素31 mg（0.13 mmol），最后加入碳酸鉀18 mg（0.13 mmol），室溫?cái)嚢?2 h。向反應(yīng)液中加入冰水15 mL，有大量白色沉淀析出。靜置，抽濾，得白色固體。用V（正己烷）∶V（異丙醇）＝6∶1 重結(jié)晶得白色粉末77 mg，產(chǎn)率61%。mp.144～148℃；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.79（s，1H），5.90（d，J＝9.9 Hz，1H），5.81（m，1H），4.88（d，J＝12.9 Hz，1H），4.87（s，1H），4.79（s，1H），4.76（s，1H），4.71～4.63（m，2H），4.56～4.48（m，2H），4.39～4.31（m，2H），3.71～3.63（m，1H），3.58～3.56（m，4H），3.52～3.47（m，10H），3.33～3.29（m，1H），3.18～3.15（m，3H），3.04～3.02（m，1H），2.96～2.91（m，1H），2.90～2.84（m，4H），2.76（t，J＝11.7 Hz，1H），2.57～2.49（m，1H），2.48～2.40（m，2H），2.31～2.25（m，1H），2.22～2.16（m，1H），1.97～1.15（m，31H），0.93～0.87（m，1H），0.85～0.82（m，3H）。13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：202.7，173.4，172.5，166.8，147.7，144.1，129.37，128.8，103.1，95.5，82.3，81.1，77.7，76.1，71.9，68.0，61.7，61.3，61.1，60.9，60.2，59.0，57.7，55.6，49.5，47.6，46.0，41.5，41.2，40.5，37.4，36.3，34.3，34.2，33.5，33.4，31.6，30.8，30.1，28.4，28.1，28.0，26.1，25.3，24.8，22.6，21.6，18.2，17.8，16.2，14.1，9.3；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C52H79N3O14S [M ＋H]＋）：1002.5361，實(shí)測(cè)值：1002.5408。

2.2.3N-（3-溴丙烷基）多殺菌素（3）的合成 向50 mL 單口圓底燒瓶中加入多殺菌素B 1 g（1.39 mmol）、乙腈20 mL 和385 mg 碳酸鉀，最后加入1，3-二溴丙烷1.42 mL（13.90 mmol），45℃下攪拌48 h。除去溶劑，加入50 mL 水，用乙醇（3×60 mL）萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。除去溶劑后經(jīng)硅膠柱層析[V（乙酸乙酯）∶V（石油醚）＝4∶1]純化，得白色固體584 mg，產(chǎn)率42%。mp.105～108℃；1H-NMR（400 MHz，CDCl3）δ：6.78（s，1H），5.87（d，J＝8.0 Hz，1H），5.80（d，J＝8.0 Hz，1H），4.88（s，1H），4.70（m，1H），4.44（m，1H），4.30（m，1H），3.63（m，1H），3.58～3.52（m，4H），3.52～3.44（m，11H），3.35～3.24（m，1H），3.20～3.00（m，3H），2.85（m，1H），2.64～2.48（m，2H），2.40（d，J＝8.0 Hz，1H），2.34～2.20（m，2H），2.16（s，4H），2.00～1.90（m，4H），1.88～1.72（m，2H），1.70（s，1H），1.60～1.40（m，8H），1.40～1.22（m，9H），1.16（d，J＝10 Hz，3H），0.90（m，1H），0.80（t，J＝7.6 Hz，3H）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：202.9，172.6，147.6，144.1，129.3，128.7，103.4，95.3，95.2，82.2，80.9，80.5，77.6，75.9，73.4，67.9，64.6，60.9，60.8，59.0，58.9，57.7，51.9，49.4，47.6，47.5，46.0，41.5，41.1，37.3，36.9，36.2，34.3，34.1，31.0，30.0，28.4，21.6，19.6，19.0，17.8，16.1，9.4；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C43H68BrNO10[M ＋H]＋）：837.4026，實(shí)測(cè)值：837.4046.

2.2.4N-（3-溴己烷基）多殺菌素（4）的合成產(chǎn)率73%，mp.95～98 ℃；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C46H74BrNO10[M ＋H]＋）：880.4574，實(shí)測(cè)值：880.4602。

多殺菌素-丙烷基-生物素（5）的合成：向50 mL 單口圓底燒瓶中加入DMF 1.5 mL、化合物3 100 mg（0.12 mmol）和D-生物素32 mg（0.13 mmol），最后加入碳酸鉀17 mg（0.12 mmol），室溫?cái)嚢?2 h。向反應(yīng)液中加入15 mL 水，用乙酸乙酯（3×25 mL）萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。除去溶劑后經(jīng)硅膠柱層析[V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝20∶1]純化，再用V（正己烷）∶V（異丙醇）＝6∶1 重結(jié)晶得白色粉末94 mg，產(chǎn)率79%。mp.146～150℃；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.78（s，1H），5.90（d，J＝9.6 Hz，1H），5.82（m，1H），5.23（s，1H），4.95（s，1H），4.87（s，1H），4.71～4.67（m，1H），4.55～4.52（m，1H），4.44（d，J＝7.1 Hz，1H），4.35～4.31（m，2H），4.16～4.12（m，2H），3.66～3.62（m，1H），3.59～3.56（m，4H），3.53～3.46（m，10H），3.33～3.27（m，1H），3.21～3.17（m，1H），3.13～3.11（m，2H），3.04～3.02（m，1H），2.99～2.93（m，1H），2.90～2.86（m，1H），2.76（d，J＝12.8 Hz，1H），2.53～2.45（m，2H），2.45～2.40（m，1H），2.37～2.33（m，2H），2.30～2.12（m，6H），1.99～1.92（m，2H），1.82～1.18（m，30H），0.96～0.88（m，1H），0.84（t，J＝7.4 Hz，3H）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：202.9，173.8，172.6，147.6，144.1，129.3，128.8，103.5，95.4，82.2，81.0，80.6，77.7，76.1，73.5，67.9，64.4，62.5，62.0，60.9，60.1，59.0，57.7，55.5，50.5，49.4，47.7，47.6，46.0，41.5，41.2，40.5，37.4，36.9，36.3，34.3，34.2，33.9，31.1，30.1，28.4，28.2，27.2，24.8，21.6，19.4，19.0，17.8，16.2，9.4；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C53H83N3O13S [M ＋H]＋）：1002.5725，實(shí)測(cè)值：1002.5772。

2.2.5 多殺菌素-己烷基-生物素（6）的合成[15]

向50 mL 單口圓底燒瓶中加入DMF 1.5 mL、化合物4 100 mg（0.11 mmol）和D-生物素32 mg（0.13 mmol），最后加入碳酸鉀17 mg（0.12 mmol），室溫?cái)嚢?2 h。向反應(yīng)液中加入15 mL水，用乙酸乙酯（3×25 mL）萃取，合并有機(jī)相，無水硫酸鈉干燥。除去溶劑后經(jīng)硅膠柱層析[V（乙酸乙酯）∶V（甲醇）＝20∶1]純化，再用V（正己烷）∶V（異丙醇）＝6∶1 重結(jié)晶得白色粉末68 mg，產(chǎn)率57%。mp.124～129 ℃；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.78（s，1H），5.90（d，J＝9.7 Hz，1H），5.82（m，1H），5.22（s，1H），4.97（s，1H），4.87（d，J＝1.3 Hz，1H），4.73～4.64（m，1H），4.57～4.50（m，1H），4.44（d，J＝6.6 Hz，1H），4.38～4.28（m，2H），4.08（t，J＝6.7 Hz，2H），3.68～3.61（m，1H），3.59～3.56（m，4H），3.54～3.46（m，10H），3.33～3.27（m，1H），3.20～3.11（m，3H），3.06～2.99（m，1H），2.96～2.92（m，1H），2.91～2.86（m，1H），2.77（d，J＝12.8 Hz，1H），2.43～2.33（m，5H），2.30～2.25（m，2H），2.19（s，3H），1.99～1.92（m，2H），1.74～1.61（m，10H），1.59～1.53（m，4H），1.52～1.45（m，6H），1.39～1.32（m，6H），1.30（d，J＝6.2 Hz，4H），1.26～1.25（m，3H），1.20（d，J＝6.8 Hz，4H），0.95～0.88（m，1H），0.84（t，J＝7.5 Hz，3H）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：202.9，173.8，172.5，147.5，144.1，129.3，128.8，103.5，95.5，82.3，81.1，80.7，77.7，76.1，73.7，68.0，64.5，64.1，61.9，60.9，60.，59.0，57.7，55.4，54.0，49.4，47.7，47.6，46.1，41.5，41.2，40.5，37.4，37.2，36.3，34.4，34.2，33.9，31.1，30.2，28.7，28.4，28.4，28.3，26.8，25.9，24.8，21.6，19.4，19.0，17.8，16.2，9.2；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C56H89N3O13S [M ＋H]＋）：1044.6194，實(shí)測(cè)值：1044.6234。

2.2.6N-甲基季銨鹽多殺菌素-己烷基-生物素（7）的合成 向25 mL 單口圓底燒瓶中加入化合物6 102 mg（0.10 mmol）、乙腈15 mL 和碘甲烷18 μL（0.29 mmol），85 ℃ 攪拌48 h。除去溶劑，V（正己烷）∶V（異丙醇）＝6∶1 重結(jié)晶得經(jīng)淡黃色固體56 mg，收率48%。mp.134～141 ℃；1H-NMR（500 MHz，CDCl3）δ：6.79（s，1H），6.00（s，1H），5.95（s，1H），5.89（d，J＝9.6 Hz，1H），5.79（d，J＝9.8 Hz，1H），4.93～4.92（m，1H），4.86（s，1H），4.72～4.60（m，2H），4.43（s，1H），4.37（d，J＝6.3 Hz，1H），4.32（m，1H），4.16～4.06（m，2H），3.82（s，1H），3.72～3.70（m，1H），3.59～3.55（m，4H），3.50～3.47（m，10H），3.30（s，3H），3.29（s，3H），3.26～3.24（m，1H），3.14～3.12（m，1H），3.10～3.06（m，2H），3.03～3.02（m，1H），2.97～3.95（m，1H），2.92～2.87（m，2H），2.44～1.15（m，44H），0.94～0.89（m，1H），0.84（t，J＝7.4 Hz，3H）；13C-NMR（125 MHz，CDCl3）δ：202.7，174.0，172.4，147.6，143.6，129.4，128.9，101.0，95.5，82.2，82.1，81.0，77.7，76.2，76.2，73.5，67.9，67.5，64.1，61.9，60.9，60.2，59.0，57.7，55.8，49.5，49.1，48.8，47.6，47.0，46.2，41.5，41.1，40.7，37.4，36.3，34.5，34.0，31.5，30.7，28.4，28.0，26.0，25.7，25.6，24.9，24.8，22.7，22.6，20.3，19.4，17.8，17.2，9.4；高分辨率質(zhì)譜計(jì)算值（C57H92N3O13S [M ＋H]＋），1058.6351，實(shí)測(cè)值 1058.6361。

2.3 抗腫瘤活性的研究

選用人乳腺癌MCF-7 細(xì)胞株（中國科學(xué)院昆明動(dòng)物研究所），應(yīng)用MTT 法[16]測(cè)試多殺菌素A和生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物分別在10、20 和40 μmol·L－1濃度下對(duì)腫瘤細(xì)胞的抗增殖活性，結(jié)果見圖4?？梢娨氩煌倪B接基團(tuán)對(duì)生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物的抗腫瘤增殖活性影響較大。在濃度為10 μmol·L－1時(shí)，多殺菌素A 和4 個(gè)生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物的抗腫瘤增殖活性均較差。在濃度為20 μmol·L－1時(shí)，多殺菌素A、化合物2、5、6、7 對(duì)MCF-7 細(xì)胞株的抑制率分別為70%、28%、2%、90%和9%，化合物6 的抑制活性最好。在濃度為40 μmol·L－1時(shí)，多殺菌素A、化合物2、5、6、7 對(duì)MCF-7 細(xì)胞株抑制率分別為100%、94%、89%、100% 和23%，化合物2、5、6 有很強(qiáng)的抑制活性，化合物 7 對(duì)MCF-7 細(xì)胞株抑制率低，表明季銨鹽形式會(huì)抑制其抗腫瘤增殖活性?；衔? 對(duì)MCF-7 細(xì)胞株的抑制率高于其他生物素標(biāo)記的衍生物2、5 和7，與母體多殺菌素A 的活性相當(dāng)，因此，化合物6 可作為小分子探針進(jìn)一步研究多殺菌素衍生物的抗腫瘤作用機(jī)制[17]。

圖4 化合物對(duì)MCF-7 的生長(zhǎng)抑制活性Fig 4 Growth inhibition of compounds to MCF-7

3 結(jié)論

本文合成了4 個(gè)全新的生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物，所有中間體和目標(biāo)化合物均經(jīng)過1H-NMR、13C-NMR、HRMS 進(jìn)行了結(jié)構(gòu)表征。體外抗腫瘤活性研究顯示生物素標(biāo)記多殺菌素衍生物6 具有較好的抗腫瘤增殖活性，可作為生物素標(biāo)記探針研究多殺菌素衍生物的抗腫瘤作用機(jī)制。