低能離子注入誘變釀酒酵母菌胞外代謝產(chǎn)物的差異性分析

白巧秀，歐科，王婷，楊倩倩，劉靜，李侃社，陳福欣*，毛培宏*

（1.西安科技大學(xué)化學(xué)與化工學(xué)院，陜西西安 710054）（2.新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，放射生態(tài)與離子束生物技術(shù)中心，新疆烏魯木齊 830046）（3.陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，陜西西安 710032）

代謝組學(xué)是功能基因組學(xué)的主要研究工具，與基因組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)一起共同構(gòu)成系統(tǒng)生物學(xué)[1]。靶向/非靶向代謝物或生物標(biāo)記物的定性和定量分析是代謝組學(xué)的重要研究目標(biāo)之一[2]。微生物代謝組學(xué)就是通過對微生物代謝物進(jìn)行定性與定量分析，來了解微生物的生理狀態(tài)[3]，微生物代謝產(chǎn)物的變化與細(xì)胞所處內(nèi)外環(huán)境密切相關(guān)，微生物生物體內(nèi)環(huán)境的變化，更多的體現(xiàn)在代謝產(chǎn)物的變化上，其中的代謝輪廓分析對深入研究微生物特別是工程菌的工業(yè)化應(yīng)用有重要的研究價值[4]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)與細(xì)胞外代謝產(chǎn)物的種類和含量受環(huán)境影響的程度是不同的，這也給代謝組學(xué)研究提出了新的挑戰(zhàn)[5,6]。

釀酒酵母菌作為重要的工業(yè)微生物之一，營養(yǎng)需求簡單，生長速度快，因此釀酒酵母菌是微生物代謝組學(xué)中的主要研究對象之一[7]。在前期研究中，課題組利用低能離子注入介導(dǎo)烏拉爾甘草（Glycyrrhiza uralensis）基因組DNA 隨機(jī)轉(zhuǎn)化釀酒酵母菌，并獲得了遺傳穩(wěn)定、醌類和萜類化合物含量顯著提高的重組酵母菌N6076；通過轉(zhuǎn)錄組測序，初步比較了差異表達(dá)基因及相關(guān)功能[8]。GO 功能分析結(jié)果表明N6076新增了14 項生物學(xué)過程、2 項細(xì)胞組分和2 項分子功能；涉及1140 個差異表達(dá)基因。此外，代謝組學(xué)的研究表明，重組酵母菌的胞內(nèi)代謝產(chǎn)物也存在明顯的差異[9]。其中甲羥戊酸-5-磷酸和胱氨酸分別為兩株酵母菌胞內(nèi)的顯著差異代謝產(chǎn)物。為了進(jìn)一步研究酵母菌的完整的代謝途徑，同時針對胞內(nèi)外代謝產(chǎn)物的差異性進(jìn)行系統(tǒng)比較；在前期研究工作的基礎(chǔ)[10]，基于超高效液相色譜-飛行時間質(zhì)譜法（UPLC-Q-TOF/MS）與代謝組學(xué)數(shù)據(jù)處理方法，對胞外的代謝提取物進(jìn)行處理及分析，獲得了重組菌株N6076 與原始菌株Kh08在不同發(fā)酵時期的胞外代謝差異，同時對兩株酵母代謝通路進(jìn)行分析，為進(jìn)一步理解酵母菌胞內(nèi)小分子化合物的代謝與重組酵母菌的進(jìn)一步遺傳改良和馴化提供一定參考。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

UPLC-Q-TOF/MS（Bruker maXis Q-TOF）超高分辨飛行時間質(zhì)譜儀，德國Bruker 公司；超凈工作臺（SW-CJ-2FD），上海滬凈醫(yī)療器械有限公司；立式壓力蒸汽滅菌器（LDZX-75KBS），上海申安醫(yī)療器械廠；臺式高速冷凍離心機(jī)（Beckman Allegra 64R），美國beckman 公司；渦旋振蕩器（Vortex1），德國艾卡公司；超低溫冰箱（ThermoFisher 88700V），美國ThermoFisher 公司；全溫振蕩恒溫?fù)u床（HZQ-2），常州市儀都儀器有限公司；電子天平（島津AUY220），日本島津公司；甲酸、乙腈、甲醇（HPLC 級），天津市大茂化學(xué)試劑公司；葡萄糖，天津市大茂化學(xué)試劑公司。

1.2 菌株來源

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）N6076 來源于低能氮離子注入介導(dǎo)外源DNA 隨機(jī)轉(zhuǎn)化釀酒酵母Kh08 獲得的遺傳穩(wěn)定的產(chǎn)醌類物質(zhì)的重組酵母菌，由新疆大學(xué)物理科學(xué)與技術(shù)學(xué)院放射生態(tài)與離子束生物技術(shù)中心保存。

1.3 培養(yǎng)條件

YPD 斜面培養(yǎng)基：酵母膏10 g、蛋白胨20 g、葡萄糖20 g、瓊脂粉10 g、蒸餾水1000 mL。液體培養(yǎng)基：葡萄糖·H2O 80 g、蛋白胨10 g、酵母膏粉5 g、KH2PO41.50 g、MgSO4·7H2O 0.50 g，蒸餾水1000 mL，pH 自然。

1.4 實驗方法

所有的實驗器具及培養(yǎng)基均在121℃下滅菌30 min。將保存在甘油管中的菌株在平板上復(fù)蘇，挑單菌落于YPD 斜面培養(yǎng)基上，并在30℃下培養(yǎng)48 h。將YPD 斜面培養(yǎng)基上培養(yǎng)48 h 的新鮮菌種置于4℃保存24 h 后接種至液體培養(yǎng)基中，置搖床150 r/min、28～30℃發(fā)酵96 h。

分別吸取培養(yǎng)0 h、48 h、96 h 的5 mL 酵母樣品菌液，加入150 μL 的Vc 溶液保護(hù)液。在4℃環(huán)境下，5000 r/min 離心5 min，收集上清液。加入等體積的氯仿，劇烈震蕩30 s，靜置10 min。收集下層無色液體，放入2 mL 凍存管中，氮?dú)獬卮蹈?，置?80℃下冷藏備用。測試時將胞外代謝產(chǎn)物復(fù)溶于200 μL 的溶液（乙腈:水=7:3）中，將樣品在12000 r/min 條件下離心5 min 后再進(jìn)行測試。

本研究設(shè)置3 個生物學(xué)重復(fù)，每個生物學(xué)重復(fù)的0 h、48 h、96 h 設(shè)置6 個技術(shù)重復(fù)。

1.5 色譜與質(zhì)譜檢測條件

UPLC-Q-TOF/MS 測試條件，色譜柱：C18（Waters BEH，50 mm×2.1 mm，1.7 μm）；柱溫：40℃；進(jìn)樣量：5 μL，流速：0.20 mL/min。流動相A 為V（乙腈）:V（水）=5:95+0.1%甲酸，流動相B 為乙腈+0.1%甲酸。梯度洗脫：0～2 min（100% A），2～3 min（100%～90% A），3～5 min（90%～60% A），5～10 min（60%～10%A）。離子源：ESI 正離子模式；毛細(xì)管電壓：3500 V，離子源溫度：200℃；氣體流速設(shè)定為8 L/min，霧化氣壓力為4 bar。m/z掃描范圍為50～1000。數(shù)據(jù)采集速率設(shè)置為0.20 s，延遲0.10 s。質(zhì)量軸以甲酸鈉為校準(zhǔn)液。

1.6 數(shù)據(jù)分析

2 株酵母菌不同發(fā)酵時間的胞內(nèi)代謝物通過UPLC-Q-TOF/MS 檢測后的數(shù)據(jù)用Data Analysis 程序轉(zhuǎn)換為CDF 格式，進(jìn)行XCMS-Online 分析，分析結(jié)果導(dǎo)入SIMCA-P，利用PLS-DA 進(jìn)行代謝物的鑒定。

2 結(jié)果與分析

2.1 酵母菌胞外代謝產(chǎn)物分析

偏最小二乘法-判別分析（PLS-DA）是多變量數(shù)據(jù)分析技術(shù)中的判別分析法，可以有效的對組間觀察值進(jìn)行區(qū)分，并且能夠找到導(dǎo)致組間區(qū)別的影響變量。

在進(jìn)行PLS-DA 分析時，0 h 代謝組樣品為一組，48 h 與96 h 為一組。重組酵母菌N6076 代謝物（圖1）與原始菌株Kh08代謝物（圖2）均能在PLS-DA分布圖中明顯區(qū)分。并且N6076 代謝物與Kh08 代謝物均基本處于95%置信區(qū)間內(nèi)，綠色圓形分別為0 h N6076 代謝物與Kh08 代謝物樣本，其全部處于置信區(qū)間的左側(cè)。藍(lán)色圓形為48 h、96 h N6076 代謝物與Kh08 代謝物樣本，主要分布在置信區(qū)間的右側(cè)。兩組樣本幾乎不重疊，都有各自的樣本聚集區(qū)域，區(qū)分效果比較明顯。說明兩種菌株的0 h 代謝物樣本與48 h、96 h 的代謝物樣本均存在顯著差異。

圖1 重組酵母菌N6076 代謝物的PLS-DA 分布圖 Fig.1 PLS-DA distribution map of the metabolites of recombinant yeast N6076

圖2 原始菌株Kh08 代謝物的PLS-DA 分布圖 Fig.2 PLS-DA distribution map of metabolites of original strain Kh08

同時得到了重組酵母菌N6076 代謝物（圖3）與原始菌株Kh08 代謝物（圖4）的載荷圖。越靠近倆邊的點(diǎn)表明其所代表的代謝物在該組中含量差別較大，而越靠近中間點(diǎn)表明該代謝物在兩組中的差異越小。N6076 代謝物與Kh08 代謝物在PLS-DA 載荷圖中均呈橢圓形，并且差異最大的部分分布在正負(fù)軸的兩側(cè)。

圖3 重組酵母菌N6076 代謝物的PLS-DA 載荷圖 Fig.3 PLS-DA loading diagram of the metabolite of recombinant yeast N6076

圖4 原始菌株Kh08 代謝物的PLS-DA 載荷圖 Fig.4 PLS-DA loading diagram of metabolites of original strain Kh08

200 次隨機(jī)排列得出檢驗結(jié)果見圖5 和圖6。如圖所示，重組酵母菌N6076 代謝物與原始菌株Kh08 代謝物PLS-DA 模型置換檢驗圖的右側(cè)點(diǎn)均高于左側(cè)相同形狀的點(diǎn)，表明模型穩(wěn)定，無過擬合現(xiàn)象。Q2 通過交叉驗證的測試數(shù)據(jù)計算得到，描述的是模型的預(yù)測能力，本模型的Q2 截距在0.1 左右，其為正值，有可能是生物樣本的實際數(shù)量過少所致[11]。

圖5 重組酵母菌N6076 代謝物的PLS-DA 模型置換檢驗圖 Fig.5 PLS-DA model replacement test diagram of the metabolites of recombinant yeast N6076

圖6 原始菌株Kh08 代謝物的PLS-DA 模型置換檢驗圖 Fig.6 PLS-DA model replacement test diagram of metabolites of original strain Kh08

2.2 酵母菌胞外代謝差異分析

采用PLS-DA 模型的VIP 值（閾值>1）來進(jìn)行差異代謝物的篩選。差異代謝物在HMDB 數(shù)據(jù)庫中通過質(zhì)荷比與庫中物質(zhì)進(jìn)行比對，從而確定重組酵母菌N6076 代謝物（表1）與原始菌株Kh08 代謝物（表2）的差異代謝物結(jié)構(gòu)信息。其中重組菌株N6076 的差異化合物為15 種（表1），原始菌株Kh08 的差異化合物為14 種（表2）。

表1 重組菌株N6076 差異性化合物 Table 1 Differential compounds of recombinant strain N6076

表2 原始菌株Kh08 差異性化合物 Table 2 Differential compounds of original strain Kh08

值得關(guān)注的是無論在重組菌株N6076還是原始菌株Kh08 中，吲哚-3-丙酸（IPA HMDB0002302）均為代謝產(chǎn)物中差異性較大的共同代謝物（或中間體），隨后將結(jié)合代謝通路分析對該化合物進(jìn)一步討論。

采用Metaboanalyst（https://www.metaboanalyst.ca/）對重組菌株N6076 與原始菌株Kh08 鑒定得到的差異代謝物進(jìn)行分析，將化合物對應(yīng)的HMDB 號輸入數(shù)據(jù)庫比對，選擇釀酒酵母（酵母）的通路分析數(shù)據(jù)得到代謝組視圖（圖9、圖10）。其中每一個氣泡代表一個通過通路富集分析得到的p值和通路拓?fù)浞治鰌athway impact values 顯示的匹配得到的代謝通路。氣泡的顏色代表富集程度的大小即縱坐標(biāo)p值，顏色越深表明富集程度越顯著[12]。

圖9 重組菌株N6076 代謝通路 Fig.9 Metabolic pathway of recombinant strain N6076

圖10 原始菌株Kh08 代謝通路 Fig.10 Metabolic pathway of original strain Kh08

差異物熱圖（圖7、圖8）的結(jié)果顯示，無論在重組菌株N6076 中，還是在原始菌株Kh08 中吲哚3-丙酸的濃度均最高，且48 h、96 h 濃度均高于0 h 重組菌株N6076 濃度。

圖7 菌株N6076 熱圖 Fig.7 Heat map of strain N6076

圖8 原始菌株Kh08 熱圖 Fig.8 Heat map of original strain Kh08

2.3 酵母菌胞外代謝通路分析

在重組菌株N6076 代謝通路中，主要涉及了Ether lipid metabolism（通路A，醚脂代謝）、Glycosylphosphatidylinositol (GPI)-anchor biosynthesis（通路B，糖基磷脂酰肌醇（GPI）-錨定生物合成）、Pantothenate and CoA biosynthesis（通路C，泛酸和CoA生物合成）、Glycerophospholipid metabolism（通路D，甘油磷脂代謝）。影響較大的代謝通路為脂類代謝。醚脂是一類獨(dú)特的甘油磷脂，它參與多種生物功能，包括調(diào)節(jié)細(xì)胞分化，影響細(xì)胞信號傳導(dǎo)，通過其潛在的內(nèi)源性抗氧化劑功能來降低氧化應(yīng)激[13,14]。甘油磷脂是機(jī)體內(nèi)含量最多的一類磷脂，構(gòu)成生物膜，參與胞膜對蛋白質(zhì)的識別和信號傳導(dǎo)[15]。

表3 重組菌株N6076 相關(guān)代謝通路 Table 3 Relevant metabolic pathways of recombinant strain N6076

2.4 吲哚-3-丙酸可能代謝通路的分析

早期的研究發(fā)現(xiàn)，吲哚-3-丙酸是一類重要的植物生長激素，可被植物的根、莖、葉和花吸收，具有促進(jìn)生根、座果等多種生理作用。此外，作為一種內(nèi)源性的微生物次級代謝產(chǎn)物，吲哚-3-丙酸也具有較強(qiáng)的抗氧化活性[16]。并且與其它抗氧化物質(zhì)不同的是，吲哚-3-丙酸在清除自由基的同時，不產(chǎn)生反應(yīng)性和促氧化性的中間化合物[17,18]。因此，推測吲哚-3-丙酸在釀酒酵母的生長及衰老過程中也可能是關(guān)鍵的調(diào)控物質(zhì)，對整個酵母菌種的馴化和篩選產(chǎn)生巨大影響[19]。

圖11 是基于現(xiàn)有數(shù)據(jù)庫推測的吲哚-3-丙酸代謝通路，圖中淺藍(lán)色表示這些代謝物僅作為富集分析的背景信息，并未被匹配到；紅色表示代謝物在數(shù)據(jù)中具有顯著性。當(dāng)然，也有文獻(xiàn)報道[20]，L-色氨酸可以通過特定的轉(zhuǎn)氨反應(yīng)和脫氨反應(yīng)生成吲哚-3-丙酸，這一生化過程簡單、明了，但是能否在酵母菌的代謝過程中發(fā)生該反應(yīng)，還需要進(jìn)一步研究。

圖11 吲哚-3-丙酸可能的代謝通路 Fig.11 Possible metabolic pathways of IPA

3 結(jié)論

基于代謝組學(xué)的方法分別對重組菌株N6076與原始菌株Kh08 的不同時期胞外代謝產(chǎn)物進(jìn)行分析，重組菌株N6076 篩選出14 種差異性代謝產(chǎn)物，原始菌株Kh08 篩選出15 種差異代謝物。其中吲哚-3-丙酸是兩種菌株中共同的差異性代謝物。通路分析發(fā)現(xiàn)，差異性代謝物均涉及醚脂代謝、糖基磷脂酰肌醇（GPI）-錨定生物合成、泛酸和CoA 生物合成、甘油磷脂代謝。其中作為共同的差異代謝物吲哚-3-丙酸，基于已有的代謝通路分析，其可能與酵母中的L-色氨酸代謝有關(guān)，進(jìn)一步的驗證工作正在實驗室中逐步開展。