樺褐孔菌總?cè)祁惢衔飳π∈蟾螕p傷的保護作用

鞠春梅，杜延佳，梁新合，吳孟雅，張輝*，李艷杰*

（1.長春中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，吉林長春 130117）（2.東北亞生物科技有限公司，吉林長春 130000）（3.長春中醫(yī)藥大學(xué)人參科學(xué)研究院，吉林長春 130117）

肝臟作為人體最大的器官，主要負責(zé)清除許多毒物、化學(xué)物質(zhì)和藥物。藥物性肝損傷是指由各種處方藥或非處方藥誘發(fā)的肝損傷，其中包括小分子化學(xué)藥物、生物制劑、中藥、天然藥物、保健品和膳食補充劑等[1]。其中對乙酰氨基酚（APAP）是一種傳統(tǒng)的非甾體解熱鎮(zhèn)痛藥物，APAP 作為日常中常見的藥物，作用相對安全，并且在治療劑量范圍內(nèi)幾乎沒有副作用，廣泛用于治療各種疼痛。然而在過去的幾年中，臨床數(shù)據(jù)監(jiān)測表明，過量服用APAP 可出現(xiàn)肝毒性、腎毒性和急性肝衰竭[2]，高劑量的APAP 在細胞色素P450 酶系統(tǒng)（即cyp2e1 和cyp3a4 同工酶）的氧化作用下生成N-乙酰-P-苯丙醌亞胺（NAPQI），NAPQI是一種高毒性代謝產(chǎn)物，可以通過大量結(jié)合谷胱甘肽，并耗盡谷胱甘肽后，與肝細胞內(nèi)蛋白質(zhì)結(jié)合，形成蛋白質(zhì)結(jié)合物，引起細胞內(nèi)氧化應(yīng)激，線粒體損傷、DNA損傷，最終導(dǎo)致肝壞死[3-5]。

樺褐孔菌被認定是一種無毒害作用的可食用真菌，在我國的黑龍江、吉林兩省資源較豐富，其作為食用真菌藥物的應(yīng)用在俄羅斯已經(jīng)通過相關(guān)部門的官方批準(zhǔn)，并獲得了美國FDA 的認證[6]。樺褐孔菌具有抗炎癥、抗腫瘤、抗真菌、抗病毒、提高機體免疫力、保肝和抗氧化等活性[7]。因具有多種生物活性，被認為是一種珍貴的、具有極好療效的藥物，也是具有發(fā)展前途和開發(fā)價值的經(jīng)濟適用性藥食同源植物。樺褐孔菌中主要含有多糖、三萜、多酚等成分。大量研究顯示，三萜類具有抗氧化、抗癌、抗病毒，抗炎和防止糖尿病[8]等功能。王文娟等[9]研究發(fā)現(xiàn)樺褐孔菌提取物能改變腫瘤細胞增殖周期使其滯留于G2 期從而顯著抑制肝癌細胞HepG2 的增值，對肝癌細胞有抑制作用，說明樺褐孔菌對肝細胞有一定的保護作用。但樺褐孔菌中三萜類是否能夠通過抗氧化應(yīng)激對APAP 引起的肝損傷有保護效果未見報道。本文以樺褐孔菌子實體為原料，經(jīng)過回流提取、硅膠柱分離純化得到樺褐孔菌總?cè)疲═riterpenoids ofInonotus obliquus，TIO），通過APAP 急性肝損傷模型實驗，探究TIO 的保肝作用，為樺褐孔菌三萜類化合物的進一步研究提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 材料

供試品TIO 由羊毛甾醇（20.00%）、樺褐孔菌醇（20.63%）、麥角甾醇（24.19%）、白樺脂醇（6.45%）、3β-羥基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛（20.76%）組成，由實驗室制備；SPF 級ICR 雄性小鼠，體重22～25 g，購自長春市億斯實驗動物技術(shù)有限責(zé)任公司，合格證號：SCX（吉）2016-0004。

1.2 主要試劑

對乙酰氨基酚（APAP），購于美國Sigma 公司；水飛薊素，購自于上海瀚鴻科技股份有限公司；丙氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（ALT）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)移酶（AST）、超氧化物歧化酶（SOD）的活性、還原型谷胱甘肽（GSH）和丙二醛（MDA）測試盒，蘇木素-伊紅染色液（HE），Hoechst 33258 染色試劑盒均購于南京建成生物工程研究所；生理鹽水購自長春豪邦藥業(yè)公司。

1.3 主要儀器

BP211D 型十萬分之一電子天平，北京賽多利斯天平有限公司；Elx800 型酶標(biāo)儀，美國Bio-Rad 公司；5430R 冷凍離心機，美國LUNAR 公司；YZ-875 超凈工作臺，蘇州凈化設(shè)備廠；KQ5200 型超聲波清洗器，昆山市超聲儀器公司；FSH-2A 可調(diào)高速勻漿機，常州金壇良友儀器有限公司。

1.4 方法

1.4.1 樺褐孔菌總?cè)疲═IO）制備

取樺褐孔菌干燥子實體粗粉適量，經(jīng)二氯甲烷水浴回流提取、除雜、減壓回收溶劑，濃縮，揮干溶劑得到干膏。干法上樣，采用硅膠柱色譜分離，以石油醚:乙酸乙酯=8:2 等度洗脫，點板合瓶分成Fr1-Fr7 組分，組分Fr2 采用石油醚:乙酸乙酯=9:1～8:2 梯度洗脫，點板合瓶，合并出5 個組分為Fr 2-1～Fr 2-5，同時純化得到3β-羥基羊毛甾-8,24-二烯-21-醛、樺褐孔菌醇和白 樺脂醇。對Fr5 組分采用中壓柱色譜分離，以石油醚:乙酸乙酯=6:4等度洗脫，得到5個組分為Fr 5-1～Fr 5-5，同時純化得到羊毛甾醇；對組分Fr 5-3 正相硅膠柱色譜層析，以石油醚:乙酸乙酯=8:2～6:4 梯度洗脫，得到3個組分，同時純化得到麥角甾醇。將五個成分按一定配比成TIO，用0.5%羧甲基纖維素鈉混懸至規(guī)定濃度，待小鼠灌胃使用。

1.4.2 動物分組及處理

將小鼠隨機分成6 組，每組8 只。表1 為動物實驗設(shè)計，空白組與模型組小鼠分別給予0.5%羧甲基纖維素鈉溶液，水飛薊素組與TIO 干預(yù)組小鼠分別按照劑量50 mg/kg、15 mg/kg、30 mg/kg 和60 mg/kg 連續(xù)7 d 灌胃給藥，末次給藥后，空白組小鼠注射0.9%的生理鹽水，除空白組小鼠外均一次性腹腔注射300 mg/kg APAP 制造肝損傷模型。24 h 后小鼠眼球取血，血液室溫凝結(jié)1 h 后，4000 r/min 離心15 min，留取上清供血清指標(biāo)檢測。切取一部分肝臟組織溶于0.9%氯化鈉中制成肝勻漿用于氧化應(yīng)激水平檢測，另取相同部位的肝組織固定在4%多聚甲醛中，用于肝組織切片觀察病理變化，其余部分立即凍存在-80℃冰箱。

表1 動物實驗設(shè)計 Table 1 Animal experiment design

1.4.3 免疫器官指數(shù)檢測

取小鼠肝臟和脾臟稱重記錄，計算臟器指數(shù)。肝臟（脾臟）指數(shù)=肝臟（脾臟）質(zhì)量/體質(zhì)量。

1.4.4 血清指標(biāo)檢測

小鼠進行眼球取血，靜置離心后留取上清液，按照試劑盒的操作說明測定檢測ALT、AST 酶活力。

1.4.5 氧化應(yīng)激指標(biāo)檢測

取-80℃凍存的小鼠肝組織，置于冰上解凍后，加入生理鹽水，制備勻漿，留取上清液，按照SOD、GSH和MDA 試劑盒的操作說明書測定相關(guān)指標(biāo)。

1.4.6 HE 染色檢測肝組織病變

將肝組織浸入4%多聚甲醛溶液，24 h 后修整，石蠟包埋，切成5 μm 切片，脫蠟至水，按HE 染色步驟進行染色，光學(xué)顯微鏡觀察肝組織病理變化。

1.4.7 Hoechst 33258 染色檢測肝細胞凋亡

從每組中隨機選擇三個肝組織，切成5 μm 切片，按Hoechst 33258 染色步驟進行染色。靜置3～5 min 后用PBS 洗滌三次。用熒光淬滅封片液封片，避光烘干后于熒光顯微鏡下觀察細胞核凋亡情況。

1.4.8 統(tǒng)計學(xué)處理

采用單因素方差分析（ANOVA）對數(shù)據(jù)進行分析，使用Graphpadprism 5.0 創(chuàng)建結(jié)果數(shù)據(jù)圖表。p<0.01 或p<0.05，具有顯著性，被認為具有統(tǒng)計意義。

2 結(jié)果與討論

2.1 對小鼠體重和器官指數(shù)的影響

動物臟器重量、臟器指數(shù)作為動物實驗中常用的重要基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，一定程度上可以反映藥物對臟器的影響或損傷程度[10]。如表2 所示，各組小鼠的初始體重差異不明顯。給藥一周后，模型組小鼠的肝臟指數(shù)為72.37、脾臟指數(shù)6.56，與空白組肝指數(shù)62.52、脾臟指數(shù)4.80 相比有明顯差異（p<0.05），說明APAP 能夠使小鼠發(fā)生肝、脾腫脹現(xiàn)象。與模型組相比，加入TIO干預(yù)與水飛薊素治療后可以降低小鼠肝臟和脾臟指數(shù)。表明不同質(zhì)量濃度TIO 對小鼠APAP 急性肝損傷均具有一定療效。因此選擇15、30、60 mg/kg 作為TIO低、中、高劑量進行干預(yù)治療。

表2 樺褐孔菌三萜對小鼠體重與器官指數(shù)的影響 Table 2 Effects of TIO on body weights and organ indices in mice (,n=8)

表2 樺褐孔菌三萜對小鼠體重與器官指數(shù)的影響 Table 2 Effects of TIO on body weights and organ indices in mice (,n=8)

注：“*”表示與模型組相比較有顯著差異（p<0.05）。

2.2 TIO 對小鼠血清生化指標(biāo)的影響及氧化應(yīng)激指標(biāo)的影響

血清中ALT、AST 屬于藥物性肝損傷的生物標(biāo)志物[11,12]，AST 和ALT 是檢測肝功能最重要、最敏感的指標(biāo)，其活性的高低直接反映了肝臟受損的程度[13]。正常狀態(tài)下ALT 和AST 存在于肝細胞漿中，當(dāng)過量服用APAP 后，當(dāng)體內(nèi)的毒性產(chǎn)物不能及時排除體外，與肝組織內(nèi)的蛋白質(zhì)結(jié)合，引起肝細胞受損，AST 和ALT 會從肝臟滲漏到細胞外間隙血液中，從而導(dǎo)致二者血清濃度急劇升高。表3 所示，空白組小鼠血清ALT和AST 分別是5.66 U/L、7.62 U/L，而模型組小鼠血清中的含量顯著上升到13.54 U/L、16.39 U/L，說明小鼠APAP 型肝損傷造模成功。水飛薊素組和TIO 干預(yù)組小鼠血清ALT 和AST 活性與模型組相比均降低，且TIO高劑量組效果最好，顯著降低血清中ALT 和AST 活力至8.38 U/L 和11.13 U/L，最高降低了47.56%，說明TIO 能夠減輕或阻斷由過氧化引起的肝細胞膜損傷導(dǎo)致的肝細胞壞死，從而達到降低ALT 和AST 效果。

表3 血清生化指標(biāo)結(jié)果 Table 3 Serum biochemical index results

氧化應(yīng)激也是藥物引起肝毒性的最常見原因[14,15]。在APAP 過量時，大量的NAPQI 產(chǎn)生會耗盡肝臟中主要產(chǎn)生的GSH[16]，當(dāng)GSH 消耗殆盡時肝臟失去清除自由基作用，肝臟新陳代謝受到影響。所以GSH 的含量直接反映了自由基損耗細胞的程度[17]。MDA 是一種膜脂過氧化物的產(chǎn)物[18,19]，通過測定MDA 的含量可以了解膜脂過氧化程度，可以間接測定膜系統(tǒng)受損程度。SOD 是保護活性氧反應(yīng)的重要的酶，可以反映機體過氧化損傷程度[20]。通過測定小鼠肝組織中SOD、GSH和MDA 的活性，進而初步確定藥物是否具有肝保護作用。表4 可見，模型組小鼠肝臟SOD 活性為510.62 U/(mg pro)、GSH 活性為93.90 U/(mg pro)；TIO 干預(yù)組相比于模型組，SOD、GSH 活性均顯著升高，且TIO高劑量組SOD 活性效果最好，其活性升高為628.39 U/(mg pro)，最高升高了49.34%。與模型組相比，TIO干預(yù)組與水飛薊素組MDA 含量均顯著降低，且TIO中劑量干預(yù)組效果最好，減少至20.71 pmol/(mg pro)，最高降低了72.23%。說明TIO 能夠通過增強SOD 及GSH 的活性，減少細胞膜脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的含量，促使肝細胞的抗氧化能力增強，從而抵御脂質(zhì)過氧化，降低肝細胞受損程度，達到保肝護肝的目的。

表4 氧化應(yīng)激指標(biāo)結(jié)果 Table 4 Oxidative stress index results

2.3 TIO 對小鼠對小鼠肝組織病理學(xué)和肝細胞凋亡的影響

肝組織的病理學(xué)檢查同樣是肝損傷診斷的有效手段，對于肝損傷有鑒別診斷及早期準(zhǔn)確的評估肝損傷至關(guān)重要。APAP 是目前應(yīng)用最廣泛的解熱鎮(zhèn)痛藥物，長期或過量服用會引起嚴重的肝損傷，主要表現(xiàn)為肝壞死，以肝臟小葉中央型壞死最為常見[21,22]，將六組肝臟組織切片進行HE 染色。結(jié)果如圖1 所示，正常小鼠肝臟可見清晰的肝小葉結(jié)構(gòu)，肝細胞排列整齊致密，細胞索呈放射狀排列在中央靜脈周圍；模型組肝組織結(jié)構(gòu)破壞，肝小葉結(jié)構(gòu)不清晰，肝細胞水腫明顯，部分肝細胞有明顯的點狀和灶狀壞死，紊亂等典型病理特征。進一步證實了APAP 誘導(dǎo)的急性肝損傷模型建立成功。相比于模型組，經(jīng)不同濃度TIO 干預(yù)及水飛薊素保護后，肝細胞狀態(tài)有所恢復(fù)，肝臟結(jié)構(gòu)較清楚，少量細胞點狀壞死，肝細胞水腫明顯減輕。TIO 高劑量組與水飛薊素組比較，無明顯差異，說明TIO 能顯著改善小鼠肝細胞變性和壞死，其治療效果較好。

圖1 TIO 對APAP 致急性肝損傷小鼠肝組織病理變化的影響（×100）Fig.1 Effect of TIO on the pathological changes of liver tissue in mice with acute liver injury induced by APAP (×100)

同時為了確定TIO 是否能緩解APAP 誘導(dǎo)的肝細胞凋亡，我們采用Hoechst 33258 染色觀察肝細胞凋亡的程度。如圖2 所示，空白組小鼠的肝細胞核形態(tài)完整，整齊排列，輪廓清晰，染色質(zhì)均勻并輕微染色。然而，模型組中可以清楚的觀察到大面積，高密度的藍色凋亡肝細胞且分布不均，細胞核縮小，呈不規(guī)則狀，且有較強熒光團出現(xiàn)。與模型組相比，用TIO 不同濃度連續(xù)干預(yù)7 d 處理后，細胞凋亡數(shù)量明顯減少，熒光團明顯減弱，且隨TIO 濃度增加，肝細胞凋亡情況明顯改善。TIO 高劑量組與水飛薊素組比較，無明顯差異，說明TIO 能明顯抑制APAP 引起的肝細胞損傷凋亡。

圖2 TIO 對APAP 致急性肝損傷小鼠肝組織凋亡的影響（×400）Fig.2 Effect of TIO on liver tissue apoptosis in mice with acute liver injury induced by APAP (×400)

3 結(jié)論

綜上所述，TIO 可以明顯減輕APAP 引起的急性肝損傷，對肝臟及其功能有一定的保護作用，在給予不同劑量TIO 干預(yù)后，血清生化指標(biāo)ALT 和AST 均顯著性降低；同時TIO 高劑量干預(yù)組升高小鼠肝組織中的氧化應(yīng)激指標(biāo)SOD 和GSH 含量，降低MDA 含量；TIO 干預(yù)后肝組織細胞壞死和紊亂現(xiàn)象明顯改善，肝細胞凋亡數(shù)量明顯減少。其機制可能通過減輕氧化應(yīng)激和抑制凋亡有關(guān)。因此對樺褐孔菌總?cè)谱鳛橐环N具有潛力的護肝功能食品原料的研究有重要意義。