外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214與急性心肌梗死患者免疫趨化因子表達(dá)的相關(guān)性

冷佰樺，孟瑜，朱志林，付文軍

急性心肌梗死（AMI）是冠狀動(dòng)脈（冠脈）粥樣硬化最重要的并發(fā)癥之一[1]，不僅涉及脂類失衡、炎癥反應(yīng)等機(jī)制[2]，且與環(huán)境、遺傳等因素導(dǎo)致的免疫系統(tǒng)紊亂密切相關(guān)[3]，其中免疫趨化因子在斑塊破裂、血小板聚集和血栓形成等過程中占據(jù)重要位置[4]。既往研究證實(shí)，趨化因子/趨化因子功能性受體2（CCR2）信號(hào)軸介導(dǎo)的信號(hào)傳遞過程在心血管疾病中呈過度激活狀態(tài)，持續(xù)聚集單核細(xì)胞亞群，促進(jìn)或加重血管內(nèi)皮組織的炎癥反應(yīng)[5]。近年來越來越多研究發(fā)現(xiàn)，miRNAs對(duì)趨化因子有一定調(diào)控作用[6,7]。miR-214是AMI發(fā)生、進(jìn)展過程中的重要分子，屬于保護(hù)性miRNAs[8]，但其調(diào)控機(jī)制尚不明確，我們?cè)谇捌谡{(diào)研工作中發(fā)現(xiàn)，miR-214存在與CCR2基因靶向結(jié)合序列，推測(cè)可能對(duì)于AMI患者免疫趨化因子的調(diào)控有一定的影響。本研究期望通過分析AMI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214表達(dá)量與免疫趨化因子的相關(guān)性，為進(jìn)一步闡述AMI的發(fā)生發(fā)展機(jī)制并尋找潛在的治療靶點(diǎn)提供新的思路。

1 資料與方法

1.1 研究對(duì)象前瞻性選擇2019年1月～2019年12月因急性胸悶胸痛于宜昌市第一人民醫(yī)院（三峽大學(xué)人民醫(yī)院）心血管內(nèi)科就診患者174例，其中男性118例，女性56例，平均年齡（59.92±9.86）歲，所有患者就診時(shí)均接受冠脈造影術(shù)（CAG）檢查。其中排除冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病（冠心?。┱?5例，為CAG正常組；其余129例確診為AMI，為AMI組，其中男性83例，女性46例，平均年齡（60.27±10.29）歲。根據(jù)心電圖結(jié)果，ST段抬高型心肌梗死患者55例（STEMI組），非ST段抬高型心肌梗死患者74例（NSTEMI組）。AMI患者納入標(biāo)準(zhǔn)：①根據(jù)缺血性胸痛的臨床病史、胸痛、胸悶等臨床癥狀（持續(xù)時(shí)間超過30 min），掃描18導(dǎo)聯(lián)心電圖（常規(guī)12導(dǎo)聯(lián)+V7～V9、V3R～V5R）的動(dòng)態(tài)演變，監(jiān)測(cè)血清心肌損傷標(biāo)志物的動(dòng)態(tài)變化，符合中華醫(yī)學(xué)會(huì)心血管病學(xué)分會(huì)所制定的AMI診斷標(biāo)準(zhǔn)[9]；②舌下含服硝酸甘油或者麝香保心丸不能完全緩解癥狀；③首次確診；④發(fā)病12 h內(nèi)就診。排除合并惡性腫瘤、肝腎功能不全、急慢性感染及其他器質(zhì)性疾病者。所有患者及家屬均被知情并簽署同意書。本研究獲我院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 樣本采集所有患者入院后立即采肘靜脈血5 ml，置于EDTA抗凝管中，采用Ficoll法分離單個(gè)核細(xì)胞（PBMCs），用4%胎盤藍(lán)染液染色，記錄活性細(xì)胞數(shù)，活細(xì)胞百分?jǐn)?shù)＞95%則可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。將PBMCs置于-80℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3 CAG由放射影像科副主任級(jí)醫(yī)師采用標(biāo)準(zhǔn)Judkins法[10]完成CAG檢查，左冠脈行6體位投照和右冠脈行4體位投照。采用飛利浦Allura Xper FD20懸吊球管平板數(shù)字血管機(jī)（荷蘭飛利浦公司）輔助圖像處理系統(tǒng)定量分析冠脈病變支數(shù)和狹窄程度，進(jìn)行SYNTAX評(píng)分[11]：＜22分為輕度病變亞組，22～32分為中度病變亞組，＞32分為重度病變亞組。

1.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR法檢測(cè)miR-214表達(dá)取PBMCs樣本，加入TRIzol裂解試劑（北京AidLab公司），采用miRNeasy血清/血漿快速提取試劑盒（北京AidLab公司）提取miRNAs，采用PrimeScript miRNA cDNA合成試劑盒（大連寶生生物工程公司）合成cDNA，37℃ 60 min（poly(A)加尾和逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)），85℃ 5 s（酶失活）。取1 μg cDNA模板采用SYBR Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒（大連寶生生物工程公司）進(jìn)行基因擴(kuò)增，95℃ 10 s（預(yù)變性），1個(gè)循環(huán)；95℃ 5 s（變性），60℃ 10 s（退火），72℃ 1 min（延伸），40個(gè)循環(huán)。PCR引物購自上海生工生物工程有限公司。miR-214擴(kuò)增上游引物為5’-GGG GCG AAT CAT TAT TTG CT-3 ’，下游引物為5 ’-GTG CGT GTC GTG GAG TCG-3’。小分子U6作為內(nèi)參，上游引物為5’-CTC GCT TCG GCA GCA CA-3 ’，下游引物為5 ’-AAC GCT TCA CGA ATT TGC GT-3’。以2-Dct表示miR-214相對(duì)表達(dá)量。

1.5 血漿單核細(xì)胞趨化蛋白-1（MCP-1）水平檢測(cè)采用ELISA試劑盒檢測(cè)血漿MCP-1水平，試劑盒購自英國Abcam公司。

1.6 Western blot法檢測(cè)PBMCs上CCR2蛋白表達(dá)量取PBMCs樣本（1×106個(gè)），加入細(xì)胞裂解液裂解后以Bradford法測(cè)定蛋白濃度，BSA為標(biāo)準(zhǔn)品；取50 μg蛋白樣本進(jìn)行5%SDS-PAGE電泳，將目標(biāo)蛋白電轉(zhuǎn)至PVDF上，一抗和二抗分別孵育，ECL法顯色。CCR2一抗購自武漢博士德公司。

1.7 血液生化指標(biāo)檢測(cè)采集空腹外周靜脈血5 ml，檢測(cè)總膽固醇（TC）、三酰甘油（TG）、高密度脂蛋白膽固醇（HDL-C）、低密度脂蛋白膽固醇（LDL-C），肌酸激酶同工酶（CK-MB）、肌鈣蛋白I（cTnI）、血漿N末端腦鈉肽前體（NTproBNP）、超敏C反應(yīng)蛋白（hs-CRP）。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理所有數(shù)據(jù)均采用SPSS 19.0統(tǒng)計(jì)學(xué)軟件分析，符合正態(tài)分布的計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，兩組間均數(shù)的比較采用t檢驗(yàn)；偏正態(tài)分布變量以中位值（P25，P75）表示，進(jìn)行秩和檢驗(yàn)。計(jì)數(shù)資料采用例數(shù)（構(gòu)成比）表示，組間比較采用χ2檢驗(yàn)。連續(xù)變量采用Pearson相關(guān)性分析。采用多重線性回歸分析不同因素之間的相關(guān)性。P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 AMI組和CAG正常組基線資料比較比較AMI組和CAG正常組受試者基線資料，兩組人群的年齡、性別構(gòu)成、體質(zhì)指數(shù)、吸煙史、飲酒史、糖尿病史、HDL-C水平比較，差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。但AMI組患者高血壓史比例、TC、TG、LDL-C、CK-MB、cTnI、NT-proBNP、hs-CRP水平均顯著高于CAG正常組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05，表1）。

表1 AMI組和CAG正常組受試者基線臨床資料比較

2.2 AMI組和CAG正常組外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平比較AMI組和CAG正常組受試者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214表達(dá)量分別為（1.00±0.13）和（0.81±0.28），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.384，P＜0.05），AMI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214表達(dá)量低于CAG正常組。

2.3 AMI組和CAG正常組血漿MCP-1濃度和外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平比較AMI組和CAG正常組受試者血漿MCP-1濃度分別為（97.85±23.86）pg/ml和（133.90±47.48）pg/ml，外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平分別為（0.48±0.16）和（0.67±0.29），經(jīng)t檢驗(yàn)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（t=4.876，4.174，P＜0.05），AMI組患者血漿MCP-1濃度和外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平均高于CAG正常組。

2.4 AMI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平和血漿MCP-1濃度、外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平的相關(guān)性經(jīng)miRWalk、miRanda、PITA、TargetScan在線生物學(xué)軟件檢索，并進(jìn)一步進(jìn)行維恩匯總分析，富集分析和文獻(xiàn)分析發(fā)現(xiàn)CCR2可能為miR-214靶基因，通過軟件分析發(fā)現(xiàn)hsa-miR-214與CCR2存在3'UTR結(jié)合區(qū)域。經(jīng)Pearson相關(guān)性分析，AMI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平和血漿MCP-1濃度、外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平均呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.590，-0.433，P＜0.05），圖1～2。

圖1 hsa-miR-214的靶基因匯總維恩圖及與CCR2基因靶向結(jié)合序列

2.5 AMI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平和CCR2蛋白水平、血漿MCP-1濃度與冠脈病變嚴(yán)重程度的關(guān)系隨著冠脈SYNTAX評(píng)分增加，患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平逐漸降低，同時(shí)外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平和血漿MCP-1濃度則逐漸升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），表2。

表2 不同冠脈病變程度患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平和CCR2蛋白水平、血漿MCP-1濃度比較

2.6 多重線性回歸分析以SYNTAX評(píng)分為因變量，納入TC、TG、LDL-C、CK-MB、cTnI、NTproBNP、hs-CRP、miR-214、MCP-1及CCR2作為因變量，進(jìn)行多元線性回歸分析，結(jié)果顯示CK-MB、cTnI、NT-proBNP、miR-214、MCP-1及CCR2與SYNTAX評(píng)分均存在線性回歸關(guān)系（P＜0.05），表3。

表3 AMI患者SYNTAX評(píng)分的多重線性回歸分析

3 討論

miRNA是普遍存在于真核生物體內(nèi)一類重要的調(diào)控相關(guān)因子轉(zhuǎn)錄后翻譯或生物合成的小分子（19～25nt）內(nèi)源性非編碼RNA，在心血管疾病領(lǐng)域中發(fā)揮著重要作用[12]，一些miRNAs逐漸被證實(shí)具有AMI診斷或靶向治療的潛力[13]。最近一項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，miR-214在小鼠心肌梗死及缺血再灌注損傷中具有一定保護(hù)作用[14]，但其作用機(jī)制尚不明確。本研究中，我們發(fā)現(xiàn)，AMI患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214表達(dá)量低于非冠心病人群，且隨冠脈病變程度的增加而進(jìn)一步降低，說明miR-214在心肌梗死中可能屬于保護(hù)性miRNAs。為進(jìn)一步探索其作用機(jī)制，通過檢索miRWalk、miRanda、PITA、TargetScan在線生物學(xué)軟件，并進(jìn)行維恩匯總分析發(fā)現(xiàn)，CCR2可能是miR-214的靶基因，兩者存在3'UTR結(jié)合序列。

圖2 AMI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平和血漿MCP-1濃度、外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平的Pearson相關(guān)性

AMI是冠脈粥樣硬化疾病的急癥表現(xiàn)，與機(jī)體非特異性免疫炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，其中趨化因子及其功能性受體介導(dǎo)的單核細(xì)胞定向移動(dòng)在誘發(fā)動(dòng)脈管壁炎癥反應(yīng)過程中發(fā)揮著關(guān)鍵作用。趨化因子家族是由一系列結(jié)構(gòu)類似的小分子肝素結(jié)合多肽組成的分泌型蛋白家族，對(duì)于單核細(xì)胞、巨噬細(xì)胞等都有一定的趨化或招募作用，不僅促進(jìn)易損斑塊破裂或血栓生成等，還參與免疫應(yīng)答、促進(jìn)刺激血管平滑肌細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞產(chǎn)生組織因子等[15]。因此趨化因子及其功能性受體表達(dá)水平升高可能是誘發(fā)動(dòng)脈管壁炎癥反應(yīng)的重要機(jī)制之一。

本世紀(jì)初，葛紅霞等[16]發(fā)現(xiàn)急性心肌梗死大鼠在建模早期，梗死區(qū)域的趨化因子包括RANTES、MIP-1α、MIG表達(dá)量即開始升高，隨后逐漸降低至正常，推測(cè)趨化因子可能是誘導(dǎo)T細(xì)胞浸潤心肌組織的始動(dòng)因子。此外，曹禹等[17]證實(shí)CCL2（即MCP-1）以自分泌/旁分泌方式參與STEMI患者殘余血小板高反應(yīng)，其作用機(jī)制可能與激活p38MAPK-HSP27信號(hào)通路有關(guān)。曲楠等[18]也證實(shí)急性心肌梗死患者CCL2/CCR2表達(dá)與血小板聚集率關(guān)系密切，CCL2/CCR2可能通過影響血小板聚集率參與心肌梗死疾病進(jìn)展。MCP-1是由成纖維細(xì)胞，平滑肌細(xì)胞，人血管內(nèi)皮細(xì)胞分泌的趨化因子CC亞家族成員之一。本研究中通過臨床實(shí)驗(yàn)證實(shí)AMI患者血漿MCP-1濃度顯著高于CAG正常組人群，與既往多數(shù)研究結(jié)論基本一致。其原因可能與趨化并激活單核/巨噬細(xì)胞，進(jìn)而啟動(dòng)動(dòng)脈管壁炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)有關(guān)。

CCR2受體是MCP-1最具親和力的G蛋白耦聯(lián)受體之一，多表達(dá)于嗜堿性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞、血管平滑肌細(xì)胞、自然殺傷細(xì)胞和T細(xì)胞等[19]。Franca等[20]認(rèn)為MCP-1及其受體CCR2表達(dá)量升高是心肌缺血再灌注損傷早期主要病理變化之一，兩者結(jié)合后可激活MCP誘導(dǎo)蛋白MCP-IP，通過上調(diào)caspase家族成員的表達(dá)，促進(jìn)心肌細(xì)胞凋亡，這可能是引起心肌梗死后心室重構(gòu)的重要作用機(jī)制之一。本研究中，我們證實(shí)了外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白隨著血漿MCP-1表達(dá)量升高而增加，且與冠脈病變程度呈正相關(guān)性。基于上述結(jié)果，MCP-1/CCR2傳導(dǎo)途徑在心肌梗死發(fā)生發(fā)展過程中發(fā)揮了重要作用，降低該通路的激活可有效防止和改善該疾病進(jìn)展。而miR-214對(duì)于MCP-1/CCR2的激活具有一定的調(diào)控作用。通過Pearson相關(guān)性分析，AMI組患者外周血單個(gè)核細(xì)胞miR-214水平和血漿MCP-1濃度、外周血單個(gè)核細(xì)胞CCR2蛋白水平均呈負(fù)相關(guān)性（r=-0.590，-0.433，P＜0.05），且與冠脈病變程度存在一定的線性關(guān)系。提示miR-214在心肌梗死后表達(dá)量降低，進(jìn)而促進(jìn)調(diào)控免疫趨化因子MCP-1/CCR2的作用，使其參與到免疫單核細(xì)胞的趨化、聚集、微炎癥反應(yīng)發(fā)生及心肌纖維重塑等進(jìn)程中，從而介導(dǎo)急性缺血后的心肌損傷機(jī)制

綜上所述，AMI患者外周單個(gè)核細(xì)胞miR-214表達(dá)量降低，且與MCP-1/CCR2傳導(dǎo)通路的激活存在負(fù)向調(diào)控關(guān)系，推測(cè)這可能是加重AMI疾病進(jìn)展的重要機(jī)制之一，從而為心血管治療靶點(diǎn)miRNAs的研究提供新的思路，但其具體調(diào)控網(wǎng)絡(luò)尚需進(jìn)一步深入探索。