中鏈脂肪酸及其酯對致病菌的抑菌作用

湯佳寧，王永俠，劉金松，曾新福，楊彩梅，*

(1.浙江農(nóng)林大學(xué) 動(dòng)物科技學(xué)院，浙江 杭州 311300； 2.浙江惠嘉生物科技股份有限公司，浙江 安吉 311107)

抗生素濫用對畜禽養(yǎng)殖業(yè)具有潛在危害，尋找綠色安全的抗生素替代物成為當(dāng)前動(dòng)物營養(yǎng)研究的熱點(diǎn)。大腸埃希菌(Escherichiacoli)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)、雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)在畜禽環(huán)境中廣泛存在，它們引發(fā)的各種疾病對養(yǎng)殖業(yè)影響巨大[1]。大腸埃希菌病的發(fā)病率和死亡率高，暴發(fā)頻繁，嚴(yán)重影響?zhàn)B雞業(yè)的發(fā)展[2]。金黃色葡萄球菌能引起皮膚、軟組織感染，以及引起心內(nèi)膜炎、敗血癥及中毒性休克等多種疾病癥狀[3]。沙門氏菌能夠?qū)е码r雞大量死亡[4]。雞白痢是嚴(yán)重危害家禽養(yǎng)殖業(yè)的傳染病[5]。

中鏈脂肪酸(MCFA)是指碳鏈長度為6～12個(gè)碳原子的飽和脂肪酸[6]。中鏈脂肪酸與甘油結(jié)合形成中鏈脂肪酸甘油酯。研究表明，月桂酸甘油酯具有抑菌作用[7]。Li等[8]報(bào)道單月桂酸甘油酯能有效防止恒河獼猴感染艾滋病毒(SIV)，為人類防止艾滋病提供了新思路，更促進(jìn)了人們對月桂酸衍生物的研發(fā)。在飼料行業(yè)，單月桂酸甘油酯可以提高油脂的消化利用率，可以顯著提高飼料報(bào)酬[9]，在肉雞飼料中添加單月桂酸甘油酯對肉品質(zhì)有顯著的提升作用[10]，并對蛋雞的生產(chǎn)性能、蛋品質(zhì)及腹脂形態(tài)等具有顯著的提升作用[11]。目前，中鏈脂肪酸甘油酯已經(jīng)成為抗生素替代物研究的新熱點(diǎn)，但除了單月桂甘油酯外，對其他中鏈脂肪酸甘油及其酯的研究較少，本試驗(yàn)旨在研究月桂酸和中鏈脂肪酸甘油酯(單月桂酸甘油酯、單辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯)對致病菌的抑菌效果，為中鏈脂肪酸甘油酯的應(yīng)用提供理論支持。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)樣品與菌種

月桂酸(lauric acid，LA)，單月桂酸甘油酯(glyceryl monolaurate，GML)，單辛酸甘油酯(glyceryl monocaprylate，GMC)，辛葵酸甘油酯(caprylic capric triglycerride，MCT)市購，純度為90%。大腸埃希菌(Escherichiacoli)K88和腸炎沙門氏菌(Salmonellaenteritidis)由浙江大學(xué)惠贈(zèng)；雞白痢沙門氏菌(Salmonellapullorum)CVCC1791、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)ATCC6538購自中國普通微生物菌種保藏中心。

1.2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

抑菌試驗(yàn)采用搖瓶法，具體步驟如下：

(1)配制LB液體培養(yǎng)基(稱取胰蛋白胨10 g，酵母提取物5 g，NaCl 10 g，用ddH2O定容至950 mL，用HCl和NaOH調(diào)節(jié)pH至7.0，再用ddH2O定容至1 L)，滅菌冷卻備用。

(2)設(shè)置空白對照組，只接菌不添加抑菌劑；實(shí)驗(yàn)組接種適宜濃度(106CFU·mL-1)的菌液并添加500 μL中鏈脂肪酸(酯)(分別為月桂酸，單月桂酸甘油酯，單辛酸甘油酯，辛葵酸甘油酯，50 mL，終濃度為1 mg·mL-1)。加樣后用錫紙封蓋以防止污染，37 ℃，180 r·min-1于搖床上振蕩培養(yǎng)，在培養(yǎng)時(shí)間為0、4、8、12、24、48 h時(shí)取培養(yǎng)液200 μL加樣于96孔板，每份樣6個(gè)重復(fù)，采用酶標(biāo)儀在波長600 nm處檢測D值。

1.3 數(shù)據(jù)處理

所得數(shù)據(jù)用SPSS Statistics V21.0進(jìn)行單因素方差(one-way ANOVA)分析，使用LSD法進(jìn)行多重比較。

2 結(jié)果與分析

2.1 中鏈脂肪酸酯對大腸埃希菌的抑菌作用

由圖1可得， 8～48 h，相較于對照組，月桂酸處理組大腸埃希菌生長顯著(P<0.05)受到抑制。4～48 h，單月桂酸甘油酯處理組大腸埃希菌生長速度顯著(P<0.05)受到抑制。單辛酸甘油酯處理的大腸埃希菌有一定程度的增殖，但生長速度顯著(P<0.05)低于對照組。4～16 h，辛葵酸甘油酯處理組大腸埃希菌生長速度顯著(P<0.05)受到抑制，24 h，對照組相較于辛葵酸甘油酯組大腸埃希菌無顯著差異。結(jié)果表明，月桂酸、單月桂酸甘油酯、單辛酸甘油酯對大腸埃希菌抑制作用存在一定的差異。

同一時(shí)間不同處理間沒有相同字母表示差異顯著(P<0.05)。下同。

2.2 中鏈脂肪酸酯對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

由圖2可得，0～8 h，月桂酸處理的金黃色葡萄球菌增殖不明顯，在整個(gè)試驗(yàn)過程中，月桂酸處理組金黃色葡萄球菌增殖速度顯著(P<0.05)低于對照組。0～4 h，單月桂酸甘油酯處理組金黃色葡萄球菌增殖速度與對照組基本一致，4 h之后，單月桂酸甘油酯處理組金黃色葡萄球菌增殖速度始終顯著(P<0.05)低于對照組。單辛酸甘油酯和辛葵酸甘油酯處理組金黃色葡萄球菌均始終顯著(P<0.05)低于對照組。表明月桂酸、單月桂酸甘油酯、單辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯對金黃色葡萄球菌均有一定的抑制作用，但存在作用時(shí)間的差異。

圖2 不同中鏈脂肪酸甘油酯對金黃色葡萄球菌的抑菌作用

2.3 中鏈脂肪酸酯對腸炎沙門氏菌的抑菌作用

由圖3可得，0～4 h，月桂酸組腸炎沙門氏菌生長速度與對照組無顯著差別，4 h后月桂酸組腸炎沙門氏菌增殖速度顯著(P<0.05)低于對照組。單月桂酸甘油酯和單辛酸甘油酯組腸炎沙門氏菌增殖速度整個(gè)試驗(yàn)期間均顯著(P<0.05)低于對照組。0～4 h，辛葵酸甘油酯處理組與對照組腸炎沙門氏菌增殖速度無顯著差異，4 h后，辛葵酸甘油酯處理的腸炎沙門氏菌生長速度顯著(P<0.05)低于對照組。月桂酸、單月桂酸甘油酯、單辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯對腸炎沙門氏菌均有一定的抑制作用，單辛酸甘油酯對腸炎沙門氏菌的抑菌效果最佳。

圖3 不同中鏈脂肪酸甘油酯對腸炎沙門氏菌的抑菌作用

2.4 中鏈脂肪酸酯對雞白痢沙門氏菌的抑菌作用

由圖4可得，在整個(gè)試驗(yàn)期，月桂酸組、單月桂酸甘油酯組、單辛酸甘油酯組雞白痢沙門氏菌增殖顯著(P<0.05)低于對照組。0～4 h，辛葵酸甘油酯組與對照組雞白痢沙門氏菌生長速度一致且增長不顯著，4～24 h，辛葵酸甘油酯組雞白痢沙門氏菌增殖顯著(P<0.05)低于對照組，24 h后，對照組相較于辛葵酸甘油酯組雞白痢沙門氏菌有上升。月桂酸、單月桂酸甘油酯、單辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌均有一定的抑制作用，但存在作用時(shí)間的差異。

圖4 不同中鏈脂肪酸甘油酯對雞白痢沙門氏菌的抑菌作用

3 討論

中鏈脂肪酸和中鏈脂肪酸甘油酯都具有特定的營養(yǎng)和代謝作用，包括快速消化、被動(dòng)吸收和強(qiáng)氧化，對幼小動(dòng)物的營養(yǎng)有著重大的意義[12]。 研究表明，中鏈脂肪酸可以通過胃黏膜被吸收，還因其能夠穿透細(xì)菌的半透膜并破壞細(xì)胞內(nèi)部結(jié)構(gòu)而具有很強(qiáng)的抗菌活性[13]。Kitahara等[14]研究表示，月桂酸+慶大霉素和月桂酸+亞胺培南組合的作用與12種組合中的臨床分離株具有協(xié)同作用。月桂酸抑菌效果未見報(bào)道，本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，月桂酸對金黃色葡萄球菌有十分顯著的抑制效果；而對腸炎沙門氏菌有較強(qiáng)的抑菌作用，對腸炎沙門氏菌出現(xiàn)了增殖前抑制。

中鏈脂肪酸甘油酯可以被完整地吸收進(jìn)入腸上皮細(xì)胞，然后被微粒體脂肪酶水解[15]。中鏈脂肪酸單甘酯可以抗病原體，其作用效果要優(yōu)于游離脂肪酸，特別是月桂酸甘油酯[6]。研究表明，日糧中添加中鏈甘油三酯可有效降低結(jié)腸和直腸中大腸埃希菌的數(shù)量[16]。中鏈脂肪酸單甘酯，尤其是月桂酸單甘酯，具有較強(qiáng)的抗菌和抗病毒的功能[16]。Lieberman等[17]綜述了單月桂酸甘油酯具有抗多種病毒如艾滋病病毒、皰癥病毒、流感病毒等的功能，以及對革蘭氏陽性菌如葡萄球菌、鏈球菌等有很強(qiáng)的抑制作用。Fortuoso等[18]研究表明，在飼料中添加100～300 mg·kg-1月桂酸單甘酯可以顯著降低肉雞感染球蟲和細(xì)菌的概率，同時(shí)顯著改善飼料轉(zhuǎn)化效率和肉品質(zhì)。Kimsey等[19]研究表明，單月桂酸甘油酯可降低細(xì)菌芽孢的耐熱性，抑制芽孢萌發(fā)和殺死芽孢。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，單月桂酸甘油酯對大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌、腸炎沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌都有著較強(qiáng)的抑制效果。張佩華等[20]研究表明，食品級單辛酸甘油酯微乳液對金黃色葡萄球菌和大腸埃希菌的最低抑菌濃度均為135 mL·L-1，具有良好的抑菌特性。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，單辛酸甘油酯對腸炎沙門氏菌有極為顯著的抑制效果，對金黃色葡萄球菌和雞白痢沙門氏菌有較強(qiáng)的抑制效果。辛葵酸甘油酯的抑菌效果未見報(bào)道，本試驗(yàn)結(jié)果顯示，辛葵酸甘油酯對金黃色葡萄球菌有著較強(qiáng)的抑制效果，對大腸埃希菌、腸炎沙門氏菌和雞白痢沙門氏菌的抑制效果較弱。

4 結(jié)論

綜上所述，月桂酸、單月桂酸甘油酯、單辛酸甘油酯、辛葵酸甘油酯均對致病菌有一定的抑菌作用。其中，單月桂酸甘油酯的抑菌效果最好，單辛酸甘油酯和月桂酸的抑菌作用次之，辛葵酸甘油酯的抑菌效果較差。