外源酶輔助發(fā)酵加工藏茶的工藝研究

賈洋洋，聶樅寧，羅興禹，楊凱輝，何春雷，2，*

(1.四川農(nóng)業(yè)大學 園藝學院，四川 成都 611130； 2.四川省藏茶產(chǎn)業(yè)工程技術研究中心，四川 雅安 625000)

藏茶是我國黑茶的典型代表，較好地順應了邊疆同胞“多肉食、少果蔬”的膳食構造，成為他們的生活必需品。近年來，黑茶因其獨特的保健功效而受到了廣大消費者的青睞[1-2]，已成為內(nèi)銷的第二大茶類。渥堆在黑茶品質(zhì)形成過程中起著主導性作用，在渥堆工序中，原料茶中的多酚類物質(zhì)、生物堿、氨基酸以及糖類化合物在微生物胞外酶，特別是多酚氧化酶和濕熱雙重作用下發(fā)生了氧化、還原、聚合、降解和絡合等一系列復雜的生化反應，進而形成了黑茶獨有的醇和濃厚口感[3-4]。但是傳統(tǒng)黑茶在制作過程中存在著諸多問題，例如渥堆周期長、生產(chǎn)效率低、衛(wèi)生條件差、勞動強度高、成品茶質(zhì)量參差不齊，以及微生物代謝毒素等問題[5]，已成為制約黑茶產(chǎn)業(yè)發(fā)展的關鍵，探索黑茶加工新工藝已成為茶界關注的焦點。

趙冰等[6]以普洱茶為試驗原料，添加從水果中制備的外源多酚氧化酶，結(jié)果表明，處理樣中的茶多酚、兒茶素、氨基酸、茶黃素、茶紅素總量和酶的活性存在著顯著的負相關，而茶褐素總量則顯著上升。楊富亞等[7]研究發(fā)現(xiàn)，多種外源酶制成的復合酶制劑有效地促進了渥堆轉(zhuǎn)化的過程，縮短了渥堆發(fā)酵的時間，增加了茶湯的滋味成分，促進了普洱茶風味的形成。本研究擬采用綠毛茶為原料，通過添加外源酶進行酶促氧化，結(jié)合濕熱轉(zhuǎn)化作用，探索藏茶加工新工藝，并以傳統(tǒng)加工的藏茶為對照進行感官及生化成分評價，為藏茶加工探索一條新的路徑。

1 材料與方法

1.1 供試茶樣及主要儀器設備

本試驗所用綠毛茶均為四川康潤茶業(yè)有限公司提供的一芽三四葉烘青毛茶，水分含量為5.37%。

主要儀器設備：101-2電熱鼓風干燥箱， 北京中興偉業(yè)儀器有限公司；FA2004B型分析天平，上海佑科儀器儀表有限公司；UV754N 紫外可見分光光度計， 上海儀電分析儀器有限公司；恒溫恒濕箱，北京雅士林試驗設備有限公司；恒溫水浴鍋，北京永光明醫(yī)療儀器有限公司；旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，上海豫康科教儀器設備有限公司；搗碎機，上海弗魯科技發(fā)展有限公司；循環(huán)水式真空泵，北京中興偉業(yè)儀器；SCIENTZ-18ND 冷凍干燥機，寧波新芝生物科技股份有限公司；AXTG18G-Ⅱ臺式通用高速離心機。

1.2 試驗方法

1.2.1 外源酶制備及其酶活性測定

外源酶的制備：將冷凍丙酮添加到洗凈去皮的土豆中，在組織搗碎機中充分攪碎，然后進行抽濾，直到用冷凍丙酮洗滌過濾至無色[8-9]，冷凍干燥，即得外源酶粉。

外源酶酶液的制備：根據(jù)試驗設計取一定量的外源酶酶粉溶于一定量0.5 mol·L-1pH 9.0的磷酸鹽緩沖液，冰浴下攪拌20 min，4 000 r·min-1離心20 min，過濾所得上清液即為外源酶酶液。

酶活力測定：取1 g外源酶酶粉溶于100 mL 1.15 mol·L-1pH 7.0的預冷磷酸鹽緩沖液中，冰浴下攪拌20 min，4 000 r·min-1離心20 min，所得上清液用來測定酶活力。將2 mL 0.1 mol·L-1鄰苯二酚(溶于1.15 mol·L-1pH 7.0的緩沖液所得)加入1 mL外源酶酶液中，在420 nm波長下測定吸光度的變化，每隔10 s記錄1次，直到3 min。用不加外源酶的反應液做空白對照，即每分鐘吸光度變化0.01為1個酶活性單位記1 U。

1.2.2 茶坯含水量的調(diào)整和新工藝茶樣的制作

參照李艷等[10]的方法將水分調(diào)整至要求。在先前單因素試驗的基礎上以酶添加量、發(fā)酵溫度、發(fā)酵時間、茶坯含水量為試驗因素，采用Box-Behnken 設計響應面分析建立數(shù)學模型，以茶葉感官審評得分為指標優(yōu)化試驗設計，求得最優(yōu)的試驗工藝參數(shù)。選取酶量(A)、發(fā)酵溫度(B)、茶坯含水量(C)、發(fā)酵時間(D)設計四因素三水平響應面試驗(表1)。

表1 Box-Behnken 設計因素及水平

取適量綠毛茶，以固定壓強(3 MPa)蒸汽滅菌30 s，待冷卻至室溫，加入酶液并揉捻，使得酶液充分均勻滲入原料中；然后將茶坯置于恒溫恒濕箱中，按照正交試驗得出的最佳工藝參數(shù)設定下進行酶促發(fā)酵；酶促發(fā)酵轉(zhuǎn)化結(jié)束后，校正溫度為80 ℃，含水量30%，每5 min通風1 min，持續(xù)60 h，取出后在80 ℃烘箱干燥得新工藝成品茶。

1.2.3 傳統(tǒng)制法茶樣制備

由雅安和龍茶廠協(xié)助制作，工藝流程：綠毛茶—蒸汽處理—渥堆、翻堆—烘干—成品茶樣。取同批原料毛茶，裝于雙層布袋中(透氣透水不漏茶)；然后混入和龍茶廠傳統(tǒng)渥堆茶堆(>2 500 kg)中，分別放置在堆心、堆面進行渥堆；每周翻堆一次，20 d后取出，在干燥箱中烘干，即傳統(tǒng)藏茶樣。

1.2.4 感官審評方法

參照GB/T 23776—2009進行感官審評。審評小組由 5 名專業(yè)評茶員組成，評分標準見表2。

表2 感官審評評分標準

1.2.5 理化指標的測定

水分測定參照GB/T 8304—2002；水浸出物測定參照GB/T 8305—2002；茶多酚總量測定參照GB/T 8313—2002；游離氨基酸總量測定參照GB/T 8314—2002；兒茶素總量按照香莢蘭素比色法測定；可溶性糖總量按照蒽酮比色法測定[11]；茶色素按照比色系統(tǒng)分析法測定[11]；香氣組分參照文獻[12]方法測定。

1.2.6 GC-MS分析方法

GC條件：Agilent HB-5MS彈性石英毛細柱(30 m×0.32 nm×0.25 μm)；進樣口溫度240 ℃；載氣為氦氣，純度≥99.999%；柱流量1.0 mL·min-1；升溫程序：初始溫度50 ℃保持5 min，以10 ℃·min-1升至250 ℃保持3 min。MS條件：離子源EI，電子能70 eV；離子源溫度230 ℃；質(zhì)量掃描范圍50～600 amu；四級桿溫度150 ℃；質(zhì)譜傳輸線溫度為280 ℃。

1.2.7 定性定量方法

結(jié)合標準質(zhì)譜庫和各香氣成分的相對保留時間進行定性，香氣組分含量用其峰面積與內(nèi)標峰面積之比表示。

1.3 數(shù)據(jù)處理

數(shù)據(jù)采用 SPSS 20.0和Excel 2016軟件統(tǒng)計分析，感官審評得分和理化數(shù)據(jù)方差均值的比較采用最小顯著差數(shù)法(LSD)。

2 結(jié)果與分析

2.1 新工藝參數(shù)的優(yōu)化結(jié)果

以酶添加量(A)、發(fā)酵溫度(B)、發(fā)酵時間(C)、茶坯含水量(D)為試驗自變量，以茶葉感官審評得分為響應值(Y)，試驗方案及試驗結(jié)果見表3。

表3 Box-Behnken 實驗設計結(jié)果

其中試驗號25～29為中心試驗，其他的為析因試驗。每項試驗均重復4次，用以估計試驗誤差。對所得數(shù)據(jù)進行回歸分析(表4)，得到感官審評得分(S)的二次回歸方程：=86.64+0.053A-2.500×10-3B+3.19C-0.051D+0.030AB+0.070AC+0.020AD-0.032BC-0.020BD-0.018CD-0.97A2-0.088B2+0.50C2-0.076D2。該模型的顯著性水平P<0.000 1，說明該模型顯著程度高。失擬誤差值P=0.549 5>0.05，說明所建回歸方程與試驗擬合性較高。C(茶坯含水量)的F值最大，A(酶添加量)次之，B(發(fā)酵溫度)和D(發(fā)酵時間)的F值最小，說明茶坯含水量和酶添加量對茶葉感官得分的影響最大。從模擬項的P值顯著性分析可知，模擬一次項C與模擬二次項A2和C2均顯著(P<0.000 1)。

表4 響應面方差分析

2.2 新工藝的最佳參數(shù)確定和驗證

圖1是感官審評得分作為響應值的各因素交互作用曲面圖。由圖1可知，感官審評得分存在最大穩(wěn)定點。回歸模型預測的新工藝的最佳參數(shù)為酶量80 U·g-1、渥堆溫度34 ℃、含水量60%、發(fā)酵時間7 h。在此條件下得到的感官審評得分的平均值是90.41，純誤差0.057%，說明測試值與理論值基本相符，分析得到的二次方程與實際情況擬合程度較好。

圖1 各因素交互作用3D曲面圖

2.3 新工藝的效果評價

2.3.1 二種工藝成品茶感官品質(zhì)對比分析

表5表明，新工藝制作的藏茶總體品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)藏茶，其表現(xiàn)在葉色更烏潤，湯色更紅濃亮，香氣更純正，滋味更濃厚回甘。

2.3.2 二種工藝茶樣常規(guī)成分對比

由表6可知，水浸出物和氨基酸呈現(xiàn)出新工藝高于傳統(tǒng)工藝，可能是由于沒有微生物消耗的結(jié)果。茶多酚、兒茶素、可溶性糖均呈現(xiàn)出新工藝高于傳統(tǒng)工藝，可能是由于發(fā)酵時間的縮短，更有利于這些成分在茶葉中的保留。酚氨比是茶湯滋味醇和與否的重要指標[13-14]，而水浸出物在一定程度上可以反映茶湯的滋味的濃強度和厚薄，氨基酸可以協(xié)調(diào)茶湯的滋味關系[15]。這些都表明新工藝茶樣的風味品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)茶樣。

2.3.3 二種工藝茶樣茶色素成分對比

兒茶素在酶促和濕熱作用下氧化聚合生成茶色素使得茶湯變得紅褐、收斂性減弱、滋味變得醇和的成分[16]。由表7可知，新工藝茶樣茶褐素含量較高，這與表5中的感官特征相符合，而傳統(tǒng)茶湯厚度不足的原因可能由于傳統(tǒng)工藝制得茶樣茶色素含量偏低造成的[17-18]。茶褐素的含量是衡量黑茶品質(zhì)好壞的一個重要的指標[19-20]，有研究表明，多種酶都參與了茶褐素的形成過程，但是具體的形成機理比較復雜還需進一步的研究，這也是造成了新工藝茶樣品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)工藝茶樣的一個重要原因。

表5 兩種工藝成品茶感官審評

表6 兩種工藝常規(guī)滋味成分比較表

表7 二種工藝茶色素含量比較表

2.4 二種工藝香氣組分比較

由表8可知，共檢測出50種香氣組分，其中醛類占比22%，萜烯類占比20%，醇類占比18%，酮類占比18%，吡咯類、烷烴類及其他類占比14%，酯類占比10%。新工藝茶樣中，醇類占比23.36%，醛類19.64%，萜烯類17.66%，酮類17.02%，酯類8.15%。其中，具有玉蘭花香、鈴蘭香和木香的β-芳樟醇增加1.69百分點，具有木香花香的α-雪松醇增加0.49百分點，具有果香的香葉基丙酮增加2.27百分點，具有檸檬香的癸醛增加4.00百分點，具有玫瑰香的壬醛增加2.65百分點，具有木香的δ-杜松烯增加5.39百分點，具有花香的順-β-羅勒烯增加0.10百分點，具有愉快香氣的苯乙酮增加2.37百分點。這些果香型的香氣物質(zhì)改善了藏茶的風味品質(zhì)，為輔助優(yōu)化藏茶制作工藝提供了一定的參考[21-23]。

表8 兩種工藝茶樣香氣物質(zhì)相對比例比較

3 討論

藏茶屬于黑茶類。黑茶之所以具有褐葉紅湯、陳香濃郁、醇和爽口的品質(zhì)特征，是在渥堆工序中由微生物及其分泌的胞外酶和濕熱綜合作用下產(chǎn)生的。黑茶的滋味成分是以茶多酚及其氧化產(chǎn)物為主的一個綜合體系，在這個體系中，有呈澀味的兒茶素、呈苦味的咖啡堿、呈甘甜的可溶性糖和呈鮮爽味的氨基酸。各種滋味成分相互消殺變調(diào)，相互作用，形成了黑茶特有的滋味口感。有研究表明，黑茶經(jīng)過殺青和揉捻的濕熱作用就使得其中的酯型兒茶素發(fā)生了水解，相對簡單的兒茶素的含量升高。在而后的渥堆工序中，茶多酚總量呈明顯的下降趨勢，但是各種兒茶素的變化卻是不同的。酯型兒茶素水解產(chǎn)生了簡單兒茶素和沒食子酸。而簡單兒茶素在酶促反應和自動氧化下形成了以茶色素為主的水溶性色素，其中茶黃素、茶紅素和茶褐素都是形成黑茶品質(zhì)的關鍵成分[24-26]。黑茶的主要香氣成分來自于茶葉本身芳香物質(zhì)的分解、轉(zhuǎn)化、異構以及渥堆工序中酶促反應。同時，黑茶的香氣組分與加工工藝有著密不可分的關系，梁敏敏等[27]研究表明，以碧香早品種夏茶為原料在調(diào)整渥堆和干燥的參數(shù)的基礎上結(jié)合做青工序研制出了高香型的黑毛茶。曾斌等[28]通過優(yōu)化不同的二次渥堆參數(shù)促進酶促反應和濕熱作用，使得黑毛茶的外形和內(nèi)質(zhì)都發(fā)生了更優(yōu)異的品質(zhì)變化。而這方面在藏茶加工工藝方面卻鮮有報道。

續(xù)表8 Continued Table 8

本試驗采用了從土豆中提取的外源酶輔助發(fā)酵加工藏茶。結(jié)果表明，人為添加外源酶也能促進渥堆工序中茶多酚、兒茶素的氧化等反應，形成藏茶的品質(zhì)。新工藝制法僅用時60 h，而茶樣發(fā)酵程度與傳統(tǒng)工藝(20 d)近乎一致，說明新工藝可有效加快綠毛茶向黑茶的轉(zhuǎn)化進程，從而避免了黑茶在傳統(tǒng)制作過程中由于帶來微生物真菌的污染[5]、品質(zhì)安全不可控、質(zhì)量參差不齊等問題。并且土豆中提取的外源酶，成本低，還不受季節(jié)限制，有可以推廣的實際價值，為后續(xù)的藏茶加工生產(chǎn)提供參考依據(jù)。

氨基酸既是茶湯鮮爽味的呈味物質(zhì)，又是形成黑茶香氣物質(zhì)的前提物質(zhì)[29]，可以有效地協(xié)調(diào)茶湯各種滋味成分，與茶湯的品質(zhì)有著顯著的正相關?？扇苄蕴悄苡行У鼐徑獠铚猩飰A和多酚類地苦澀味和刺激性作用[30]。新工藝和傳統(tǒng)渥堆中的酶促反應都可以促進氨基酸和可溶性糖的增加，但是傳統(tǒng)渥堆中由部分微生物進行生長代謝需要消耗相關的氮源和碳源，這也可能是新工藝茶樣中的糖和氨基酸高于對照樣的原因。水浸出物是溶于茶湯中的一切呈味物質(zhì)的總和，在一定程度上可以決定茶葉品質(zhì)質(zhì)量的高低。

與傳統(tǒng)茶樣對比，新工藝茶樣的氨基酸，可溶性糖和水浸出物均高于對照樣，這也表明了新工藝的茶樣的品質(zhì)優(yōu)于傳統(tǒng)茶樣。感官審評結(jié)果表明，新工藝茶樣帶有花香、甜香，湯色更橙紅明亮，滋味更醇和濃厚，這也與生化成分測定的分析是一樣的，酚氨比低于對照樣，其他成分高于對照樣。充分證明新工藝可有效地改善藏茶的外形，香氣，滋味和葉底，提高藏茶品質(zhì)。

4 總結(jié)與展望

傳統(tǒng)藏茶加工工藝：鮮葉—攤放—殺青—揉捻—渥堆—干燥。而綜合整個試驗結(jié)果，外源酶輔助發(fā)酵加工藏茶的新工藝的較佳工藝參數(shù)為酶量80 U·g-1、渥堆溫度34 ℃、含水量60%、發(fā)酵時間7 h，即酶輔助新工藝流程為：綠毛茶—加入酶液—酶輔助發(fā)酵—濕熱轉(zhuǎn)化—烘干—成品茶樣。此條件下加工的藏茶茶樣具有明顯的陳香及獨特香氣，極大地改善了傳統(tǒng)黑茶的陳味及霉味。新工藝目前在生化試驗階段中取得了突破性的進展，如若想廣泛地應用到實際的大生產(chǎn)當中還需要進行進一步的優(yōu)化和探究。