苯并呋喃酮的高效液相色譜分析

王 怡，李春艷，龐懷林

(1.上海泰禾化工有限公司，上海 201615；2.南通泰禾化工股份有限公司，南通 226407)

苯并呋喃酮，又名為2-苯并呋喃酮、苯并呋喃-2(3H)-酮、2-香豆冉酮，其結(jié)構(gòu)式見圖1。苯并呋喃酮是許多有機(jī)合成原料、天然產(chǎn)物分子和生物藥物中間體的重要結(jié)構(gòu)單元，可廣泛用于藥物、食品和材料等領(lǐng)域[1-3]，而且還是農(nóng)業(yè)上高效廣譜殺菌劑嘧菌酯合成工藝的重要中間體[4]。

圖1 苯并呋喃酮的結(jié)構(gòu)式

目前對(duì)苯并呋喃酮的檢測(cè)方法較少，僅見張文娟測(cè)定苯并呋喃酮原藥的相關(guān)研究[5]，此方法簡(jiǎn)練高效，但因其峰保留時(shí)間短，一般能滿足原藥的分析，但無(wú)法適用需分離衍生物、雜質(zhì)的苯并呋喃酮試樣。為廣泛地適用多規(guī)格產(chǎn)料需求，建立一種兼顧快速分析與雜質(zhì)有效分離的苯并呋喃酮分析方法十分必要?？紤]到嘧菌酯工藝生產(chǎn)過程中與鄰羥基苯乙酸、對(duì)甲苯磺酸等原料的分離，一般選擇乙腈與水混合溶劑作為流動(dòng)相體系，或在有機(jī)相中加入磷酸或甲酸等[6]以調(diào)節(jié)pH和改善峰型，提高后續(xù)合成中與嘧菌酯的分離檢測(cè)?；谏鲜鎏攸c(diǎn)，本文采用高效液相色譜法，通過對(duì)不同流動(dòng)相組合及分析條件的探索和驗(yàn)證，確定了苯并呋喃酮測(cè)定中流動(dòng)相優(yōu)先選擇乙腈+磷酸水混合溶液，并加入了一定比例的甲醇以改善拖尾現(xiàn)象，提高與雜質(zhì)的分離度和選擇性，建立了苯并呋喃酮的高效液相色譜測(cè)定方法。該方法具有分離效果好、操作簡(jiǎn)單快速的特點(diǎn)，適用于苯并呋喃酮試樣的定量分析。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

LC-20AD型高效液相色譜儀配SPD-M20A二極管陣列檢測(cè)器，及色譜工作站Labsolution (日本島津公司)；ML204型電子天平(瑞士梅特勒托利多集團(tuán))；2200T型超聲波清洗儀(上海安譜科學(xué)儀器有限公司)；Direct 8型純水超純水一體機(jī)(德國(guó)默克集團(tuán))；濾膜：0.45 μm (有機(jī)相，上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)。

乙腈，色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；甲醇，色譜純(上海安譜實(shí)驗(yàn)科技股份有限公司)；磷酸，分析純(國(guó)藥集團(tuán))；苯并呋喃酮標(biāo)樣，已知質(zhì)量分?jǐn)?shù)99.0% (南通泰禾化工有限公司提供，上海曉明檢測(cè)技術(shù)服務(wù)有限公司定值)；苯并呋喃酮試樣樣品(南通泰禾化工股份有限公司)。

1.2 色譜條件

檢測(cè)器為二極管陣列檢測(cè)器，色譜柱為島津WondaSil-WR C18色譜柱(250 mm×4.6 mm i.d.不銹鋼柱，內(nèi)裝5 μm填充物)；流動(dòng)相為乙腈-甲醇-0.1%磷酸水溶液，經(jīng)濾膜過濾和脫氣，采用梯度洗脫(表1)，流速為1.0 mL/min；檢測(cè)波長(zhǎng)為268 nm；柱溫為(35±2) ℃；進(jìn)樣體積為10 μL。在上述色譜操作條件下，苯并呋喃酮的保留時(shí)間約為10.1 min。苯并呋喃酮標(biāo)樣和試樣的高效液相色譜圖見圖2、圖3。

表1 梯度洗脫時(shí)間程序設(shè)置

圖2 苯并呋喃酮標(biāo)樣的高效液相色譜圖(1 000 μg/mL)

圖3 苯并呋喃酮試樣的高效液相色譜圖 (1 000 μg/mL)

1.3 溶液的配制

1.3.1 標(biāo)樣溶液的配制

稱取約0.06 g (精確至0.000 1 g)苯并呋喃酮標(biāo)樣置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并超聲，待溶液冷卻至室溫后用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻備用。

1.3.2 試樣溶液的配制

稱取約0.08 g (精確至0.000 1 g)苯并呋喃酮試樣置于50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并超聲，待溶液冷卻至室溫后用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻備用。

1.4 測(cè)定

在上述操作條件下，待儀器基線穩(wěn)定后，連續(xù)注入數(shù)針標(biāo)樣溶液，待相鄰2針的峰面積相對(duì)變化小于1.0%，按照標(biāo)樣溶液、試樣溶液、試樣溶液、標(biāo)樣溶液的順序進(jìn)樣測(cè)定。

1.5 計(jì)算

將測(cè)得的2針試樣溶液以及試樣前后2針標(biāo)樣溶液中苯并呋喃酮峰面積分別進(jìn)行平均。試樣中苯并呋喃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)X(%)按式(1)計(jì)算：

式中：X為試樣中苯并呋喃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；A2為試樣溶液中苯并呋喃酮峰面積的平均值；m1為標(biāo)樣的質(zhì)量的數(shù)值(g)；P為標(biāo)樣中苯并呋喃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(%)；為標(biāo)樣溶液中苯并呋喃酮峰面積的平均值；m2為試樣的質(zhì)量的數(shù)值(g)。

2 結(jié)果和分析

2.1 流動(dòng)相的選擇

為實(shí)現(xiàn)快速分離檢測(cè)，對(duì)乙腈、甲醇、純水、磷酸水溶液等多種有機(jī)相+水相組合，在C18色譜柱上進(jìn)行比較選擇，經(jīng)試驗(yàn)比較確定流動(dòng)相為乙腈和0.1%磷酸水溶液體系為主，加入甲醇的情況下，峰型不對(duì)稱、拖尾的情況有較大改善；與加入5%、8%、12%的甲醇相比，在加入10%甲醇時(shí)，與雜質(zhì)分離度高、保留時(shí)間短，可較大程度提高檢測(cè)效率。

2.2 分析方法特異性

本試驗(yàn)采用HPLC-DAD峰純度分析法來(lái)鑒別苯并呋喃酮。苯并呋喃酮標(biāo)樣的最小峰純度相似度為1.00，最小峰純度閾值為1.00，最小峰純度指數(shù)為0，說(shuō)明標(biāo)樣色譜峰中不含有雜質(zhì)峰；苯并呋喃酮試樣中的苯并呋喃酮HPLC-DAD峰純度中最小峰純度相似度為0.999 9，最小峰純度閾值為0.999 9，最小峰純度指數(shù)為4，說(shuō)明樣品色譜峰中不含有雜質(zhì)峰。標(biāo)樣與試樣的色譜峰保留時(shí)間差在1.0%以內(nèi)，如圖2和圖3所示。標(biāo)樣和試樣的峰純度圖如圖4、圖5所示。

圖4 苯并呋喃酮標(biāo)樣中的目標(biāo)峰純度

圖5 苯并呋喃酮試樣中的目標(biāo)峰純度

2.3 分析方法的線性相關(guān)性的測(cè)定

以苯并呋喃酮質(zhì)量濃度(x)為橫坐標(biāo)，峰面積(Y)為縱坐標(biāo)，繪制苯并呋喃酮的標(biāo)準(zhǔn)曲線，結(jié)果見圖6?？梢姡?dāng)苯并呋喃酮質(zhì)量濃度為231.66～2 084.94 μg/mL，與其相應(yīng)的苯并呋喃酮峰面積之間呈現(xiàn)出良好的線性關(guān)系，其線性回歸方程為Y=3 828x+43 666，相關(guān)系數(shù)R2=0.999 9。

圖6 苯并呋喃酮的質(zhì)量濃度與其相應(yīng)峰面積的線性關(guān)系圖

2.4 分析方法的精密度試驗(yàn)

對(duì)同一試樣準(zhǔn)確連續(xù)稱取6個(gè)試樣，在上述的色譜操作條件下進(jìn)行分析，測(cè)得苯并呋喃酮的質(zhì)量分?jǐn)?shù)，試驗(yàn)結(jié)果詳見表2?？梢?，苯并呋喃酮的標(biāo)準(zhǔn)偏差和變異系數(shù)分別為0.09和0.13%，說(shuō)明此分析方法精密度良好，能滿足日常的定量分析。

2.5 分析方法的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

稱取約0.04 g (精確至0.000 1 g)苯并呋喃酮試樣置于50 mL容量瓶中，分別加入不同質(zhì)量的苯并呋喃酮標(biāo)樣(精確至0.000 1 g)于同一50 mL容量瓶中，用流動(dòng)相溶解并超聲，待溶液冷卻至室溫后用流動(dòng)相稀釋至刻度，搖勻后，按1.2節(jié)色譜操作條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果見表3?？梢姡讲⑦秽幕厥章蕿?9.79%～100.22%，平均回收率為100.02%，說(shuō)明該方法準(zhǔn)確度良好，能滿足日常的定量分析。

表2 苯并呋喃酮試樣的精密度試驗(yàn)

表3 苯并呋喃酮的準(zhǔn)確度試驗(yàn)

2.6 非分析物干擾試驗(yàn)

在評(píng)價(jià)時(shí)，需要包含非分析物的干擾，防止有效成分中存在其他干擾物導(dǎo)致分析方法出現(xiàn)誤差。以空白溶劑為不含有效成分的空白樣品，其高效液相色譜圖如圖7所示，經(jīng)與圖2、圖3對(duì)比發(fā)現(xiàn)空白溶劑中不含有效成分的干擾物質(zhì)。

圖7 苯并呋喃酮溶劑空白的高效液相色譜圖

3 結(jié) 論

本文采用高效液相色譜法建立了快速測(cè)定苯并呋喃酮試樣中苯并呋喃酮的定量定性方法。該方法采用C18不銹鋼色譜柱和二極管陣列檢測(cè)器，乙腈、甲醇和0.1%磷酸水為流動(dòng)相，測(cè)得苯并呋喃酮的精密度和準(zhǔn)確度高、線性關(guān)系良好，具有操作簡(jiǎn)便、檢測(cè)過程穩(wěn)定、結(jié)果準(zhǔn)確、分離效果好等特點(diǎn)，可用于苯并呋喃酮生產(chǎn)過程中的質(zhì)量控制和分析檢測(cè)。