參仙升脈的心電生理作用及其增快竇房結(jié)自主心率機制的研究

陳英，黃郁文，王春華，王程瑜，林明杰，朱彥，趙步長，吳林

竇房結(jié)功能不全臨床常見[1]，發(fā)病率隨年齡增長而增高[2]，病因包括竇房結(jié)本身病變和（或）調(diào)節(jié)竇房結(jié)功能的自主神經(jīng)系統(tǒng)紊亂及代謝異常等[3-4]。迷走神經(jīng)抑制劑或擬交感神經(jīng)藥物在治療指南中為Ⅱ級推薦[1]，但不良反應(yīng)常見且嚴重，難以長期應(yīng)用；永久心臟起搏器是主要治療手段[5]，但存在接受度差，并發(fā)癥風險和不能實現(xiàn)生理起搏的問題。

參仙升脈口服液是中藥復方制劑，可增大心肌細胞環(huán)磷酸腺苷（cAMP）/環(huán)磷酸鳥苷（cGAMP）比值、提高鈉泵活性、上調(diào)腎上腺素β1 受體和乙酰膽堿酯酶的表達，下調(diào)尼古丁受體的表達，增大竇房結(jié)起搏電流（If），提高竇房結(jié)自律性[6-9]，從而增快輕、中度竇房結(jié)功能不全患者的最低及平均心率[10-11]。本研究利用豚鼠離體心臟灌流模型，明確參仙升脈口服液萃取劑參仙升脈（SXSM）增快竇房結(jié)自主心率的機制及其對房室結(jié)傳導、心房電生理指標和冠狀動脈導流率的影響。

1 材料與方法

1.1 參仙升脈口服液中糖和離子濃度的測定及有效成分的萃取

取5 支參仙升脈口服液（山東步長制藥股份有限公司，10 ml/每支）作為待測樣本，采用生化流水線（羅氏公司，瑞士）進行檢測分析。通過正丁醇法萃取后，平均每支參仙升脈口服液得到固體可溶性成分16 mg（即1.6 mg/ml），萃取后的固體成分即SXSM。

1.2 Langendorff 離體心臟灌流

動物模型制備：實驗動物的使用符合北京大學第一醫(yī)院實驗動物倫理委員會要求，采用的58 只雄性Hartley 豚鼠購買于北京西山昌陽養(yǎng)殖場，體重250～350 g，麻醉后，均開胸取出心臟，按照文獻[12]的方法進行Langendorff 離體心臟灌流。經(jīng)連接在灌流系統(tǒng)側(cè)面的壓力傳感器持續(xù)監(jiān)測冠狀動脈灌注壓。根據(jù)研究目的保持自主心律或心房起搏心律，測量藥物干預前后的各項指標。

給藥方法和分組：取46 只豚鼠離體心臟隨機分為5組，每組藥物均經(jīng)生理鹽水溶解并采用微量注射泵注入灌流系統(tǒng)：（1）SXSM組（n=22，10 只測量自主心率和心電圖指標，6 只測量房室結(jié)傳導指標，6 只測量心房電生理指標和冠狀動脈導流率）：給予不同濃度梯度的SXSM（0.01 ml/L、0.03 ml/L、0.06 ml/L、0.10 ml/L、0.30 ml/L、0.60 ml/L、1.00 ml/L、1.30 ml/L、1.60 ml/L、2.00 ml/L）；（2）異 丙腎上腺素組（n=6）：給予不同濃度梯度的異丙腎上腺素（0.01 nmol/L、0.03 nmol/L、1.00 nmol/L、3.00 nmol/L、6.00 nmol/L、10.00 nmol/L）；（3）乙酰膽堿組（n=6）：給予不同濃度梯度的乙酰膽堿（0.01 μmol/L、0.10 μmol/L、0.30 μmol/L、1.00 μmol/L、3.00 μmol/L、10.00 μmol/L、30.00 μmol/L）；（4）SXSM+乙酰膽堿預防組（n=6）：先持續(xù)給予SXSM（1.00 ml/L）預處理心臟，穩(wěn)定10 min 后，再給予上述濃度梯度的乙酰膽堿；（5）乙酰膽堿+SXSM 治療組（n=6）：同一只心臟先持續(xù)給予乙酰膽堿（3.00 μmol/L）穩(wěn)定10 min后記錄心率，再依次加上不同濃度梯度的SXSM（0.10 ml/L、0.30 ml/L、0.60 ml/L、1.00 ml/L、1.30 ml/L）。

1.3 心電信號的采集和測量

自主心率：將單極特氟龍涂層記錄電極放置在右心房上部接近竇房結(jié)位置，記錄每次干預前后共10 次自主心房搏動，計算平均心房率。

心電圖：采用具備Wilson 終端的非接觸式12導聯(lián)心電圖記錄系統(tǒng)（哈佛儀器公司，美國），經(jīng)Biopac 心電放大系統(tǒng)處理后存儲于計算機，使用AcqKnowledge 4.2.1 軟件測量相關(guān)參數(shù)（P 波時限、QRS 波群時限、PR 間期、QT 間期）。

SH 間期和 HV 間期的測量：在房間隔置入雙極特氟龍涂層電極。使用Grass-S88X 型刺激儀（Astro-Med 公司，美國）以250～300 ms 的固定周期進行起搏，方波脈沖持續(xù)時間為3 ms，起搏電壓至少是閾值的3 倍。使用記錄電極置于室間隔部，直到記錄到清晰穩(wěn)定的希氏束電圖。首次起搏信號至希氏束信號峰值的時間是SH 間期，代表房室結(jié)傳導時間；希氏束信號峰值至心室信號峰值的時間是HV 間期，代表室內(nèi)傳導時間。

心房有效不應(yīng)期（aERP）和90%復極完成時的心房動作電位時程持續(xù)時間（aMAPD90）的測量：在固定頻率起搏刺激（S1）的基礎(chǔ)上給予聯(lián)律間期逐漸縮短的程序性期前刺激（S2），最長的、未能引起S2 刺激的S1S2 間期值為aERP。使用J 形MAP 記錄電極（哈佛儀器公司，美國）記錄左心房心耳部的心房動作電位時程（MAPD）。Spike Ⅱ軟件用于測量aMAPD90。心房復極后不應(yīng)期（aPRR）定義為aERP與aMAPD90的差值。

冠狀動脈灌注壓的測量：在固定頻率起搏心臟，經(jīng)連接在灌流系統(tǒng)側(cè)面的壓力傳感器持續(xù)監(jiān)測。冠狀動脈導流率計算公式：冠狀動脈導流率=灌流速度 (10 ml/min)/ 冠狀動脈灌注壓。

1.4 蛋白免疫印跡實驗

余下的12 只豚鼠按如上方法行Langendorff 離體心臟灌流實驗，持續(xù)灌流60 min，期間同時以微量泵灌注給藥，4 只不給藥，4 只給予3.00 μmol/L乙酰膽堿，4 只在給予3.00 μmol/L 乙酰膽堿基礎(chǔ)上又給予1.00 ml/L SXSM。之后剪取心房組織，使用液氮研磨法提取心房組織蛋白，通過蛋白免疫印跡法測定不同分組乙酰膽堿M2受體（mAChR2）蛋白相對表達水平，其中所用一抗為ab2805（Abcam，英國）。

1.5 統(tǒng)計學方法

SXSM 固體成分稱量后換算成口服液體的容積數(shù)進行制圖和分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標準差表示，圖形均采用GraphPad Prism Version 6.0 制作，同一心臟在用藥前后的數(shù)值采用重復測量的oneway 多變量分析方法進行比較，t檢驗比較各組均數(shù)之間是否有差異。P＜0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 不同濃度參仙升脈口服液中葡萄糖及電解質(zhì)濃度

所用5 支參仙升脈口服液中，含葡萄糖（346.6±29.7）mmol/L，鉀（131.8±4.5）mmol/L，鈉（206.0±26.8）mmol/L，氯（139.3±20.5）mmol/L，鈣（0.9±0.2）mmol/L，鎂（8.3±2.7）mmol/L和磷（3.4±1.4）mmol/L。萃取后SXSM固體中無上述成分。

2.2 SXSM 對豚鼠離體心臟電生理參數(shù)和冠狀動脈導流率的影響（表1）

表1 參仙升脈對心電生理參數(shù)和冠狀動脈導流率的影響（±s，n=6～10）

表1 參仙升脈對心電生理參數(shù)和冠狀動脈導流率的影響（±s，n=6～10）

注：SH 間期：心房刺激到希氏束傳導時間，代表房室結(jié)傳導時間；HV 間期：希氏束到心室激動的傳導時間，代表室內(nèi)傳導時間；aERP：心房有效不應(yīng)期；aMAPD90：心房單相動作電位在復極完成90%時的時程；aPRR:心房復極后不應(yīng)期；CC：冠狀動脈導流率；EC50：半數(shù)有效劑量。與用藥前相比*P＜0.05，與0.10 ml/L 相比△P＜0.05，與1.00 ml/L 相比▲P＜0.05。1 mmHg=0.133 kPa。＃：所選為SXSM 的濃度梯度（0.01 ml/L、0.03 ml/L、0.06 ml/L、0.10 ml/L、0.30 ml/L、0.60 ml/L、1.00 ml/L、1.30 ml/L、1.60 ml/L、2.00 ml/L）中有代表性的濃度。-：無

SXSM（0.10～2.00 ml/L）呈濃度依賴性增快心率，增加幅度（24.2±5.3）次/min，在（1.00～2.00）ml/L 作用達到穩(wěn)態(tài)水平；SXSM（1.00～2.00 ml/L）呈濃度依賴性顯著延長PR 間期[延長幅度（32.8±5.4）ms]、SH 間期[增加幅度（40.8±2.4）ms]，顯著縮短心房aMAPD90、aERP 和aPRR，縮短幅度分別為（5.7±0.9）ms、（26.3±10.7）ms 和（21.7±4.6）ms；SXSM 從0.01～2.0 ml/L 呈濃度依賴性顯著升高冠狀動脈導流率[升高幅度為（0.18±0.04）ml/（min·mmHg），1 mmHg=0.133kPa]，但對P 波、PR 間期、QRS 波群、QT 間期、QTc 間期、HV 間期無影響。SXSM 濃度＞2.00 ml/L 可發(fā)生二度及以上房室阻滯。

異丙腎上腺素（0.01～10.00 nmol/L）也呈濃度依賴性顯著增快心率、縮短SH 間期，升高冠狀動脈導流率。但異丙腎上腺素組心率增加幅度高于SXSM組[（117.0±26.0）次/min vs.（24.2±5.3）次/min，P＜0.05]，且心率增快與異丙腎上腺素濃度增加呈近似線性相關(guān)（圖1A）。異丙腎上腺素SH 間期縮短幅度為 [（14.0±1.9）ms，P＜0.05]，對HV 間期無影響，作用特征與SXSM（延長SH 間期）不同（圖1B）。冠狀動脈導流率升高幅度與SXSM組相比無顯著差異[（0.14±0.02）ml/（min·mmHg）vs.（0.18±0.04）ml/（min·mmHg），P＞0.05]。異丙腎上腺素＞10.00 nmol/L 可引發(fā)快速性心律失常。

圖1 不同濃度參仙升脈與異丙腎上腺素對心率和房室結(jié)傳導時間影響的實驗記錄代表圖（n=6）

2.3 SXSM 對乙酰膽堿引起的心動過緩的預防和治療作用（圖2）

乙酰膽堿（0.01～30.00 μmol/L）可濃度依賴性將心率從（202.6±2.4）次/min 降至0 次/min，半數(shù)有效劑量（EC50）為（1.9±1.2）μmol/L；SXSM（1.00 ml/L）預處理后，乙酰膽堿引起心率下降的EC50為（8.6±4.0）μmol/L，是乙酰膽堿組的（4.1±1.7）倍（圖2A）。乙酰膽堿（3.00 μmol/L）將心率從（214.0±11.4）次/min降至（124.0±16.2）次/min，給予 SXSM（0.10～2.00 ml/L）治療后，心率呈濃度依賴性升高至（191.4±23.5）次/min，增加幅度為（67.4±25.0）次/min，心率增加幅度顯著高于SXSM組[（67.4±25.0）次/min vs.（24.2±5.3）次/min，P＜0.05]（圖2B）。

圖2 參仙升脈對乙酰膽堿導致的心動過緩的預防和治療作用（n=6）

2.4 SXSM 對心房組織mAChR2 蛋白的影響

4 只給予乙酰膽堿的心臟心房組織mAChR2蛋白相對表達量顯著高于4 只未給藥者[（138.0±44.0）% vs.（48.0±22.0）%，P＜0.05]；而在給予3.00 μmol/L 乙酰膽堿基礎(chǔ)上又給予1.00 ml/L SXSM 的4 只心臟心房肌組 織mAChR2蛋白的相對表達量較只給予乙酰膽堿者顯著降低[（51.0±11.0）% vs.（138.0±44.0）%，P＜0.05]。

3 討論

本研究結(jié)果表明：（1）SXSM（0.10～2.00 ml/L）濃度依賴性增高竇房結(jié)固有心率；SXSM 增快心率在高濃度下達到穩(wěn)態(tài)水平，而異丙腎上腺素增快心率的作用幅度明顯高于SXSM，且隨著濃度的增長線性增高心率；對P 波、QRS 波群、QT 間期和QTc間期無影響；（2）SXSM（1.00～2.00 ml/L）濃度依賴性延長PR 間期和SH 間期，同時縮短aMAPD90、aERP 和aPRR，在濃度＞2.00 ml/L 則可引起二度及以上房室阻滯，而異丙腎上腺素縮短SH 間期且當濃度＞10.00 nmol/L 可引發(fā)快速性心律失常；（3）SXSM（0.01～2.00 ml/L）濃度依賴性增高冠狀動脈導流率；（4）SXSM（1.00 ml/L）預處理心臟，可使乙酰膽堿致心動過緩的量效曲線右移（4.1±1.7）倍；（5）SXSM（0.10～2.00 ml/L）可濃度依賴性增高乙酰膽堿導致的心動過緩，且心率升高幅度高于SXSM組；（6）SXSM 可逆轉(zhuǎn)乙酰膽堿造成的心房肌組織mAChR2蛋白表達水平增高。

豚鼠離體心臟模型因為無神經(jīng)支配，可測量自主心房率代表竇房結(jié)固有心率[12]。本研究表明SXSM 增快離體心臟的固有竇性心率，與傳統(tǒng)治療緩慢性心律失常的藥物異丙腎上腺素相比有下列明顯的不同：SXSM 增快心率在基礎(chǔ)心率減慢（如乙酰膽堿處理后）時更明顯，當藥物濃度增加到（1.00～2.00）ml/L 之后增大作用處于平臺期；而異丙腎上腺素增快心率的量效關(guān)系為線性增高，過高劑量（≥10.00 nmol/L）可致心律失常；SXSM 可延長SH間期，而異丙腎上腺素則縮短SH 間期；臨床研究也表明，異丙腎上腺素用于起搏器依賴患者時有68%可引發(fā)異位心律[13]。這些結(jié)果提示二者作用機制存在不同，使得SXSM 在治療竇房結(jié)功能不全，特別是慢快綜合征時較異丙腎上腺素有其優(yōu)勢。

SXSM（1.00 ml/L）預處理可使乙酰膽堿減慢自主心率的量效關(guān)系曲線右移（4.1±1.7）倍，增快心率的幅度在使用乙酰膽堿使基礎(chǔ)心率減慢后更大，表明SXSM 增快心率的作用主要與拮抗膽堿能神經(jīng)功能增高有關(guān)，因此可能對臨床與迷走神經(jīng)刺激相關(guān)的心動過緩療效更好。迷走神經(jīng)系統(tǒng)的張力增高是臨床常見的引起緩慢性心律失常的病因，主要見于老年、長期運動或運動員心臟、急性下后壁心肌梗死和血管迷走性暈厥[14]等疾病的發(fā)病過程中。SXSM 抗迷走神經(jīng)的作用機制，可解釋臨床治療中SXSM 提高患者基礎(chǔ)心率和平均心率，并可作為患者起搏治療前后的補充治療[15-16]。

mAChR2 主要在心房表達。迷走神經(jīng)興奮時，乙酰膽堿作用于mAChR2，激活抑制性G 蛋白，抑制腺苷酸環(huán)化酶，降低細胞內(nèi)cAMP 的濃度，減少HCN4 通道介導的If電流速度和幅度[17-19]，從而降低竇房結(jié)細胞的自律性。SXSM 逆轉(zhuǎn)乙酰膽堿引起的心房肌組織mAChR2 蛋白表達水平增高，可解釋其增快竇房結(jié)固有心率的作用機制與抑制迷走神經(jīng)興奮相關(guān)的機制有關(guān)，這些結(jié)果與既往文獻報告的SXSM 增高cAMP 相一致[9]。

SXSM 在低濃度（0.08±0.02 ml/L）有明顯的冠狀動脈擴張作用，表現(xiàn)為冠狀動脈灌注壓降低和導流率增高。最大作用強度與異丙腎上腺素相近，提示SXSM 可能改善心肌和竇房結(jié)的血液供應(yīng)，對缺血性心臟病合并的竇房結(jié)功能不全更有益。SXSM 的這個冠狀動脈擴張機制也可能用于解釋臨床研究中參仙升脈口服液改善冠心病患者合并的緩慢性心律失常的較好療效[20]。

需要指出的是，本研究使用的是參仙升脈口服液萃取后的可溶性固體成分SXSM，臨床應(yīng)用的參仙升脈口服液含有一定濃度和劑量的糖與電解質(zhì)成分，應(yīng)用于具體患者（如糖尿病和腎功能不全合并高血鉀等）時，應(yīng)注意可能帶來的相關(guān)問題。

本研究局限性在于：（1）離體心臟為去神經(jīng)心臟，所得結(jié)果僅代表竇房結(jié)固有心率，與交感和迷走神經(jīng)雙重影響下的整體動物的研究結(jié)果可能有一定不同；（2）SXSM 縮短aERP 與aMAPD90后可能產(chǎn)生的致心律失?；蚩剐穆墒СＷ饔眯枰M一步研究。

總之，SXSM 可增快竇房結(jié)固有心率，心率增快的幅度與迷走神經(jīng)刺激造成的心動過緩程度有關(guān)，對乙酰膽堿誘導的心動過緩有預防和治療作用，作用特征與目前常用的抗心動過緩藥物異丙腎上腺素明顯不同；作用機制與其抑制乙酰膽堿M2受體的表達有關(guān)；SXSM 同時具有延長房室結(jié)傳導時間、增加冠狀動脈血流的多重藥理學作用，可能用于迷走神經(jīng)張力高，特別是合并缺血性心臟病的竇房結(jié)功能不全的治療。

利益沖突：本文作者聲明，研究由國家自然科學基金與步長集團提供的部分橫向基金支持，用于開展竇房結(jié)功能不全離體心臟電生理研究模型的開發(fā)及參仙升脈作用機制的對照研究