芝麻素對(duì)糖尿病心肌病的保護(hù)作用及機(jī)制研究

郭振，劉方圓，安鵬，汪銘煜，楊丹，楊政，樊迪，唐其柱

糖尿病心肌?。―CM）是1 型和2 型糖尿病最為嚴(yán)重且常見(jiàn)并發(fā)癥之一[1]。DCM 的主要機(jī)制是高血糖和晚期糖基化終產(chǎn)物的產(chǎn)生，導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙，引起炎癥和氧化應(yīng)激的增加[2]，其主要特征是心肌結(jié)構(gòu)和功能的改變，表現(xiàn)為早期心肌順應(yīng)性降低和舒張期充盈受阻的舒張功能不全，晚期收縮功能不全[3]。

芝麻素（sesamin，SES）是一種木脂素類植物營(yíng)養(yǎng)素，是芝麻籽和芝麻油的主要成分之一[4]。研究表明，它具有多種生物學(xué)功能，包括抗氧化應(yīng)激[5-7]、抗炎[8-9]、抗高血壓[10]的作用。而其在DCM 中的作用尚少見(jiàn)報(bào)道，結(jié)合SES 具有的抗炎、抗氧化的藥理作用，本研究猜想SES 是否可以改善鏈脲佐菌素（streptozotocin，STZ）誘導(dǎo)的糖尿病心肌損害。

1 材料與方法

主要試劑與材料：SES（#607-80-7）購(gòu)自上海融禾醫(yī)藥科技發(fā)展有限公司（上海），其純度≥99%。STZ 購(gòu)自Sigma Aldrich（St Louis，MO，美國(guó)），血糖、丙二醛（MDA）、超氧化物歧化酶（SOD）檢測(cè)試劑盒購(gòu)自南京建成生物試劑公司（江蘇，中國(guó)），白細(xì)胞介素1β（IL-1β）、白細(xì)胞介素6（IL-6）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）等引物由生工生物工程公司合成（上海），細(xì)胞DCMEM 培養(yǎng)基和胎牛血清購(gòu)自GIBCO Life Technologies（GIBCO，美國(guó)）。羊抗兔二抗（美國(guó)CST 公司，7074）；反轉(zhuǎn)錄試劑盒和實(shí)時(shí)PCR（RT-PCR）試劑（瑞士Roche 公司，4896866001），SYBRGreen I Master（瑞士Roche 公司4707516001）。定量RT-PCR 儀（瑞士R oche 公司，型號(hào):LC480），酶標(biāo)儀（美國(guó)伯騰儀器有限公司，Synergy HT）。

動(dòng)物分組及給藥方法：50 只健康雄性C57BL/6J小鼠，8 周齡，體重在18～23 g，購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院動(dòng)物研究所。實(shí)驗(yàn)小鼠經(jīng)過(guò)1 周檢疫后，將周齡及體重達(dá)標(biāo)且健康的雄性小鼠入組。將小鼠隨機(jī)分為5組（每組8 只）：對(duì)照組、SES組、DCM組、DCM+二甲雙胍（MET，10 mg/kg）灌胃組（簡(jiǎn)稱DCM+MET組）以及DCM+SES（100 mg/kg）灌胃組（簡(jiǎn)稱DCM+SES組）[11]。

DCM 模型建立：小鼠給與腹腔注射STZ（溶于0.1 mol/L 的檸檬酸鹽緩沖液中，pH=4.5，50 mg/kg），連續(xù)注射5 d。一周后，斷尾采血檢測(cè)其空腹血糖平均值≥16.6 mmol/L，且出現(xiàn)糖尿病典型癥狀，表示糖尿病模型建立成功。對(duì)照組小鼠注射等體積檸檬酸鹽溶液。STZ 注射12 周后進(jìn)行MET 和SES 持續(xù)灌胃4 周。4 周后取出小鼠心臟用于病理和分子生物學(xué)分析。

葡萄糖耐量試驗(yàn)（OGTT）：小鼠麻醉取材前一天，饑餓處理16 h。葡萄糖（2.0 g/kg）灌胃，分別在0、30 min、60 min 和120 min 使用血糖儀測(cè)量小鼠血糖濃度。

心肌肌鈣蛋白I（cTnI）和肌酸激酶同工酶（CKMB）水平：MET 和SES 持續(xù)灌胃4 周后，麻醉前取小鼠眼眶下靜脈叢血液，室溫下放置2 h 后離心獲得血漿上清。使用cTnI 和CK-MB 檢測(cè)試劑盒，按照說(shuō)明書檢測(cè)血清cTnI 和CK-MB 水平。

SOD 活性和MDA 含量檢測(cè)：MET 和SES 持續(xù)灌胃4 周后收集各組小鼠心臟組織按照試劑盒說(shuō)明書檢測(cè)S0D 活性及MDA 水平。

二氫乙啶（DHE）染色檢測(cè)心肌氧化應(yīng)激水平：取材后的小鼠心臟經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，脫蠟水合、DHE 染色、熒光顯微鏡下拍照。

免疫組化檢測(cè)炎癥浸潤(rùn)程度：取材后的小鼠心臟經(jīng)脫水、石蠟包埋、切片后，脫蠟水合、檸檬酸抗原修復(fù)、10%羊血清封閉后，孵育TNF-α、CD45 一抗4℃過(guò)夜，次日復(fù)溫，應(yīng)用二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色，拍照。

RT-PCR 檢測(cè)信使RNA（mRNA）表達(dá)水平：取出凍存的心臟組織每個(gè)檢測(cè)樣品15 mg，加入1 ml TRiZOL 研磨制成勻漿。按照總RNA 提取步驟獲得樣品組織總RNA。每個(gè)組織樣品取出2 μg 總RNA逆轉(zhuǎn)錄獲得互補(bǔ)DNA。使用SYBR GREEN I RTPCR 體系檢測(cè)心肌細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)。

蛋白免跡印跡（Western blot）檢測(cè)炎癥和氧化應(yīng)激標(biāo)志物的蛋白水平：取心臟組織或H9c2 細(xì)胞，研磨后加入RIPA 裂解液進(jìn)行裂解，提取蛋白并定量。每孔蛋白上樣量50 μg 進(jìn)行聚丙烯酰胺凝膠（SDSPAGE）電泳。轉(zhuǎn)膜，封閉后分別孵育一抗，4℃過(guò)夜，次日二抗孵育1 h 后顯色。以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）作為內(nèi)參，采用Image-Pro Plus 6.0 軟件檢測(cè)各條帶的吸光度（A）值。

細(xì)胞培養(yǎng)Sirt3 抑制試驗(yàn)：心肌H9c2 細(xì)胞使用10% FBS/DCMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)。心肌H9c2 細(xì)接種在六孔板上培養(yǎng)，1×104細(xì)胞數(shù)/孔。在37℃、5%二氧化碳（CO2）培養(yǎng)箱中常規(guī)培養(yǎng)24 h。將細(xì)胞分為8組：①對(duì)照組[5.5 mmol/L 葡萄糖（GLU）培養(yǎng)24 h]、②SES組[11]（10 mmol/L 處理24 h）、③高糖（HG）組（33 mmol/L GLU刺激24 h）、④HG+SES組（33 mmol/L GLU+10 mmol/L SES 24 h），及在前四組的基礎(chǔ)上分別添加Sirt3 選擇性抑制劑（3-TYP，50 μmol/L 處理24 h）即：⑤對(duì)照+3-TYP組、⑥SES+3-TYP組、⑦HG+3-TYP組、⑧HG+SES+3-TYP組。細(xì)胞處理結(jié)束后使用細(xì)胞增殖檢測(cè)（CCK8）試劑盒（碧云天）檢測(cè)心肌H9c2 細(xì)胞的存活率。

統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：數(shù)據(jù)分析采用SPSS 23.0 數(shù)據(jù)分析軟件。計(jì)量資料采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 各組血糖水平和心肌損傷標(biāo)志物比較（圖1）

圖1 各組小鼠血糖水平和心肌損傷標(biāo)志物的比較（各組n=8）

HE 染色結(jié)果表明，對(duì)照組心肌細(xì)胞排列整齊，結(jié)構(gòu)清晰；DCM組心肌組織結(jié)構(gòu)排列紊亂，結(jié)構(gòu)不清晰，細(xì)胞核膜皺縮破裂（圖1A），可證明DCM 模型構(gòu)建成功。在OGTT 試驗(yàn)中分別檢測(cè)四個(gè)時(shí)間點(diǎn)小鼠餐后0 min、30 min、60 min 和120 min 的血糖水平。各組小鼠餐后血糖水平在60 min 時(shí)間達(dá)到高峰，DCM組小鼠血糖水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05），DCM+SES組和DCM+MET組小鼠餐后血糖水平顯著低于DCM組（P＜0.05），而DCM+MET組 與DCM+SES組小鼠餐后血糖水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖1B）。

DCM組小鼠cTnI、CK-MB 水平均顯著高于對(duì)照組（P均＜0.05），DCM+SES組和DCM+MET組小鼠cTnI、CK-MB 水平均顯著低于DCM組（P均＜0.05），而DCM+MET組與DCM+SES組小鼠cTnI、CK-MB 水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖1C、1D）。

2.2 SES 對(duì)DCM 小鼠心肌組織氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響（表1、圖2）

表1 各組小鼠MDA 和SOD 含量比較(各組n=8,±s）

表1 各組小鼠MDA 和SOD 含量比較(各組n=8,±s）

注：SES：芝麻素;DCM：糖尿病心肌病；MET：二甲雙胍；MDA：丙二醛；SOD：超氧化物歧化酶。與對(duì)照組比較*P＜0.05;與DCM組比較▲P＜0.05

圖2 SES 對(duì)DCM 小鼠心肌組織氧化應(yīng)激狀態(tài)的影響（各組n=8）

DCM組小鼠脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 顯著高于對(duì)照組，而SOD 活性含量顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；DCM+SES組心肌組織中MDA 顯著低于DCM組，而SOD 含量顯著高于DCM組（P＜0.05），而DCM+MET組與DCM+SES組間MDA/SOD 含量水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，表1）。

DHE 染色結(jié)果表明，DCM組小鼠的DHE 陽(yáng)性強(qiáng)度明顯強(qiáng)于對(duì)照組（P＜0.05），DCM+SES組和DCM+MET組小鼠的DHE 陽(yáng)性強(qiáng)度顯著低于DCM組（P＜0.05），且DCM+MET組與DCM+SES組之間差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2A、2B）。

RT-PCR 結(jié)果表明，DCM組小鼠的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸（NADPH）氧化酶功能亞基（p22phox、p67phox以及gp91phox）mRNA 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05），DCM+SES組小鼠的p22phox、p67phox以及gp91phoxmRNA 表達(dá)水平顯著低于DCM組（P均＜0.05），且DCM+MET組與DCM+SES組 間p22phox、p67phox及gp91phoxmRNA 表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖2C）。

Western blot 結(jié)果表明，DCM組小鼠的SOD2/p67phox蛋白表達(dá)水平明顯低于/高于對(duì)照組（P均＜0.05），DCM+SES組小鼠心肌組織的SOD2/p67phox蛋白表達(dá)水平顯著高于/低于DCM組（P均＜0.05），且DCM+MET組與DCM+SES組間SOD2/p67phox蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖2D）。

2.3 SES 對(duì)糖尿病小鼠心肌組織炎癥的影響（圖3）

免疫組化染色結(jié)果表明，DCM組小鼠的CD45和TNF-α 陽(yáng)性區(qū)域明顯高于對(duì)照組，DCM+SES組小鼠心肌組織的CD45 和TNF-α 陽(yáng)性區(qū)域顯著低于DCM組（P均＜0.05），且DCM+MET組與DCM+SES組間CD45 和TNF-α 陽(yáng)性區(qū)域差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05，圖3A、3B）。

RT-PCR 結(jié)果表明，DCM組小鼠的IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平明顯高于對(duì)照組（P均＜0.05），DCM+SES組和DCM+MET組小鼠的IL-6、IL-1β 和TNF-α mRNA 表達(dá)水平顯著低于DCM組（P均＜0.05，圖3C）。

Western blot 結(jié)果表明，DCM組小鼠的TNF-α蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（P＜0.05）；DCM+SES組和DCM+MET組小鼠的TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著低于DCM組（P＜0.05），而DCM+MET組 與DCM+SES組間TNF-α 蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖3D）。

圖3 SES 對(duì)DCM 小鼠心肌組織炎癥的影響（各組n=8）

2.4 SES 通過(guò)上調(diào)Sirt3 對(duì)抗高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥紊亂及細(xì)胞的損傷（圖4）

Western blot 結(jié)果表明，DCM組小鼠的Sirt3 蛋白表達(dá)水平顯著低于對(duì)照組（P＜0.05）；DCM+SES組小鼠的Sirt3 蛋白表達(dá)水平顯著高DCM組（P＜0.05，圖4A、4B）。

細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，通過(guò)設(shè)置不同的濃度梯度（0～50 mmol/L）的SES，在10 mmol/L 時(shí)，SES 能夠最大限度的保護(hù)由高糖引起的心肌細(xì)胞損傷，同時(shí)又能較明顯的激活Sirt3。細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中，HG+SES組的活性氧（ROS）水平顯著低于HG組（P＜0.05）；應(yīng)用3-TYP后，HG+SES+3-TYP組 與HG+3-TYP組ROS 水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05，圖4C）。Western blot 結(jié)果表明，在未加3-TYP 的條件下，SES 均可改善高糖誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激、炎癥狀態(tài)和凋亡（圖4D）。HG+SES組SOD2/p67phox蛋白表達(dá)水平顯著高于/低于HG組（P均＜0.05），HG+SES+3-TYP組與HG+3-TYP組SOD2 和p67phox蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）；HG+SES組TNF-α 蛋白表達(dá)水平顯著低于HG組（P＜0.05），HG+SES+3-TYP組 與HG+3-TYP組TNF-α蛋白表達(dá)水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）;HG+SES組BCL-2/BAX 蛋白表達(dá)水平顯著高于/低于HG組（P均＜0.05），HG+SES+3-TYP組 與HG+3-TYP組BCL-2 和BAX 蛋白表達(dá)水平差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P均＞0.05）。HG+SES組細(xì)胞存活率顯著高于HG組[（87.68±8.64）% vs.（55.67±7.85）%，P＜0.05]，HG+SES+3-TYP組 與HG+3-TYP組 細(xì)胞存活率差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[（55.39±8.32）%vs.（59.67±7.42）%，P＞0.05，圖4E]。

圖4 SES 通過(guò)上調(diào)Sirt3 對(duì)抗高糖導(dǎo)致的心肌細(xì)胞氧化應(yīng)激和炎癥紊亂及細(xì)胞的損傷（各組n=6）

3 討論

長(zhǎng)期以來(lái)，糖尿病一直對(duì)人類健康有著巨大的威脅。糖尿病患者易并發(fā)DCM，可以造成不可逆轉(zhuǎn)的心肌重構(gòu)和心力衰竭，甚至引發(fā)心血管事件和死亡發(fā)生[12]。針對(duì)DCM 患者理想的治療藥物應(yīng)該可以改善DCM 患者的葡萄糖代謝、心肌細(xì)胞內(nèi)氧化應(yīng)激和炎癥，而不會(huì)引起任何不良反應(yīng)。然而，長(zhǎng)期使用常規(guī)的抗糖尿病藥物進(jìn)行治療和預(yù)防會(huì)帶來(lái)副作用并且對(duì)DCM 的緩解作用并不顯著。世界衛(wèi)生組織糖尿病專家委員會(huì)宣布，400 多種傳統(tǒng)藥物有作為DCM 替代療法應(yīng)用潛力[13]。良好的血糖控制是延緩或阻止糖尿病慢性并發(fā)癥發(fā)生發(fā)展的重要措施[14]。本研究表明，SES 同MET 可顯著降低糖尿病小鼠的血糖水平并可顯著改善STZ 引起的心臟損傷。

炎癥是DCM 的重要病理特征[15]，高血糖和游離脂肪酸代謝增加與IL-6、TNF-α、單核細(xì)胞趨化蛋白-1 和核因子κB（NF-κB）等促炎細(xì)胞因子上調(diào)有關(guān)[16]。研究表明，SES 可通過(guò)減少心肌細(xì)胞凋亡和減輕炎癥反應(yīng)來(lái)改善心肌梗死引起的心功能障礙[17]。在本研究中，與DCM組相比，SES 治療降低了CD45 和TNF-α 在心肌組織中的表達(dá)，表明SES 治療減少了炎癥細(xì)胞的浸潤(rùn)。SES 治療降低了糖尿病小鼠心肌中TNF-α 等炎癥因子mRNA 的水平，其抗炎作用與MET 治療效果無(wú)顯著差異。這些數(shù)據(jù)表明SES 在控制DCM 中減輕炎癥方面有重要作用。

氧化應(yīng)激增加與DCM 相關(guān)的生化和結(jié)構(gòu)變化有著關(guān)鍵作用。SES 通過(guò)抑制氧化應(yīng)激，對(duì)阿霉素誘導(dǎo)的急性肝腎毒性具有典型的保護(hù)作用[18]。SES通過(guò)抗氧化應(yīng)激對(duì)STZ 誘導(dǎo)的胰腺細(xì)胞損傷具有保護(hù)作用[19]。此外，高糖高脂引起的心肌細(xì)胞損傷和凋亡可能與NADPH 氧化酶大量表達(dá)相關(guān)[20]。與這些結(jié)果相一致的是，SES 顯著降低了STZ 誘導(dǎo)的脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物MDA 含量的上升，以及明顯提升了SOD 活性。此外，SES 處理可降低由STZ 誘導(dǎo)的心肌ROS 的生成以及NADHP 氧化酶功能亞基的表達(dá)。本研究發(fā)現(xiàn)SES 可重建氧化及抗氧化平衡。

Sirt3 是線粒體中的一個(gè)重要的煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（NAD）依賴的去乙酰化酶，能夠調(diào)控線粒體中許多代謝酶的活性。Sirt3 在控制ROS 穩(wěn)態(tài)中起關(guān)鍵作用。Sirt3 能夠通過(guò)降低細(xì)胞ROS 水平來(lái)阻斷心肌肥厚[21]。研究表明，線粒體sirtuin 家族參與了糖尿病患者的胰島素抵抗[22]。Sirt3 可以預(yù)防甚至逆轉(zhuǎn)糖尿病引起的視網(wǎng)膜、骨骼和心臟損傷[23-24]。SES 介導(dǎo)的Sirt3 上調(diào)通過(guò)抑制ROS 產(chǎn)生和下游信號(hào)通路阻斷心臟重構(gòu)反應(yīng)[11]。與之前研究相一致[25]，SES 和MET 上調(diào)Sirt3 的表達(dá)。為了探究Sirt3 是否在SES 對(duì)DCM 的保護(hù)作用中起著關(guān)鍵作用，本研究應(yīng)用3-TYP 來(lái)抑制Sirt3 的表達(dá)。與期望符合的是，3-TYP 在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)中的應(yīng)用消除了SES 抗炎癥、抗氧化應(yīng)激和抗凋亡的保護(hù)作用，表現(xiàn)為SES 不能逆轉(zhuǎn)相關(guān)蛋白的表達(dá)。

本研究證實(shí)了SES 在STZ 誘導(dǎo)的DCM 損傷中的治療作用。SES 顯著的降血糖作用、抗氧化應(yīng)激以及抗炎等等多種生理作用均被證實(shí)。更重要的是，SES 主要通過(guò)上調(diào)Sirt3 的表達(dá)來(lái)發(fā)揮抗氧化應(yīng)激、抗炎和抗凋亡的作用。本研究仍存在一定的局限性。SES 激活Sirt3 的機(jī)制需要進(jìn)一步的探索發(fā)現(xiàn)。本研究通過(guò)使用Sirt3 的外源性抑制劑3-TYP，進(jìn)一步證實(shí)SES 通過(guò)Sirt3-SOD2 依賴途徑保護(hù)高糖誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷?？傊?，本研究結(jié)果為常見(jiàn)廣泛植物預(yù)防和治療DCM 提供有效證據(jù)，并且為DCM 治療藥物的研發(fā)提供了新思路。

利益沖突：所有作者均聲明不存在利益沖突