褐藻多糖硫酸酯通過(guò)調(diào)控PCNA-AS1表達(dá)對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響

王洪玉，任紅娟，陳霞

（1.南陽(yáng)市社旗縣婦幼保健院婦產(chǎn)科，河南 南陽(yáng) 473300；2.南陽(yáng)市中心醫(yī)院婦產(chǎn)科，河南 南陽(yáng) 473000）

宮頸癌是最常見(jiàn)的女性生殖器官惡性腫瘤，具有較高的發(fā)病率和致死率。手術(shù)切除、放療、化療是宮頸癌主要的治療方法,然而這些治療方法副反應(yīng)較大，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量。近年來(lái)，天然植物或其主要成分的抗腫瘤作用受到日益關(guān)注。褐藻多糖硫酸酯（Fucoidan）是從褐藻中提取的一種硫酸化多糖，主要由巖藻糖和硫酸基組成，具有抗腫瘤、抗氧化、抗炎等多種生物活性[1]。研究顯示，褐藻多糖硫酸酯可能通過(guò)下調(diào)HDAC1表達(dá)誘導(dǎo)胃癌細(xì)胞凋亡[2]；褐藻多糖硫酸酯通過(guò)調(diào)控p38 MAPK/ERK和PI3K/Akt 信號(hào)通路誘導(dǎo)肝細(xì)胞癌細(xì)胞凋亡并抑制細(xì)胞增殖[3]。目前,褐藻多糖硫酸酯對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其作用機(jī)制還未知。長(zhǎng)鏈非編碼RNA（long non-coding RNA,lncRNA）是一類長(zhǎng)度超過(guò)200 個(gè)核苷酸的小分子非編碼RNA，其參與調(diào)控細(xì)胞的增殖、凋亡、遷移等多種生命過(guò)程,與人類疾病尤其是腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[4,5]。增殖細(xì)胞核抗原的反義RNA1(proliferating cell nuclear antigen antisense RNA1，PCNAAS1)是近年來(lái)新發(fā)現(xiàn)的一種lncRNA，在結(jié)直腸癌、胃癌、肝細(xì)胞癌等腫瘤中表達(dá)升高，參與腫瘤的發(fā)生發(fā)展[6-8]。目前，還未見(jiàn)PCNA-AS1 影響宮頸癌發(fā)生發(fā)展的相關(guān)報(bào)道。本研究以宮頸癌Hela細(xì)胞為研究對(duì)象,主要觀察了褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響及其能否調(diào)控PCNA-AS1表達(dá)發(fā)揮抗宮頸癌作用,以期為其用于宮頸癌的治療提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞和實(shí)驗(yàn)試劑 褐藻多糖硫酸酯，純度>99.0%,貨號(hào)140193，上海西寶生物科技股份有限公司；宮頸癌Hela細(xì)胞株，貨號(hào)TCHu187，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS），貨號(hào)11011-8611，浙江天杭生物科技有限公司；RPMI 1640 培養(yǎng)基，貨號(hào)31800，北京索萊寶科技有限公司；PCNA-AS1的小干擾RNA（si-PCNAAS1）及亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）、PCNA-AS1過(guò)表達(dá)載體（pcDNA-PCNA-AS1）、空載體（pcDNA），廣州銳博生物科技有限公司；LipofectamineTM 2000 試劑盒（貨號(hào)11668-027）和Trizol試劑（貨號(hào)15596-026）美國(guó)Invitrogen 公司；逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（貨號(hào)K1622），美國(guó)Fermentas 公司；PCR試劑盒，貨號(hào)QP-01013，成都福際生物技術(shù)有限公司；PCR 引物，上海生工生物工程有限公司設(shè)計(jì)并合成；二喹啉甲酸（bicinchoninicacid，BCA）蛋白檢測(cè)試劑盒，貨號(hào)P0009，上海碧云天生物技術(shù)有限公司；膜聯(lián)蛋白V（Annexin V）-異硫氰酸熒光素（FITC）/碘化丙啶（Propidium Iodide，PI）細(xì)胞凋亡試劑盒，貨號(hào)KGA1014，江蘇凱基生物技術(shù)股份有限公司；細(xì)胞周期蛋白D1（CyclinD1）（貨號(hào)sc-8396）、P21（貨號(hào)sc-6246）和甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde -3 -phosphate dehydrogenase，GAPDH）（貨號(hào)sc-47724）抗體，美國(guó)Santa Cruz 公司；B 淋巴細(xì)胞瘤-2 (B-cell lymphoma-2，Bcl-2）（貨號(hào)ab32124）和B 淋巴細(xì)胞瘤-2 相關(guān)蛋白（Bcl-2-associated X protein，Bax）（貨號(hào)ab32503）抗體，美國(guó)Abcam 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染 復(fù)蘇Hela細(xì)胞，加入含10% FBS的RPMI 1640 培養(yǎng)基（常規(guī)培養(yǎng)基），置于37℃、CO2體積分?jǐn)?shù)5%、濕度97%的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。倒置顯微鏡觀察細(xì)胞生長(zhǎng)狀況，及時(shí)更換培養(yǎng)基。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)80 %時(shí)，0.25%胰蛋白酶消化，進(jìn)行傳代培養(yǎng)。取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的Hela細(xì)胞，以每孔1×105個(gè)接種于6 孔板中。待細(xì)胞生長(zhǎng)密度達(dá)60%時(shí)，更換不含F(xiàn)BS的培養(yǎng)基，分別將PCNAAS1 小干擾RNA（si-PCNA-AS1）、亂序無(wú)意義陰性序列（si-NC）、PCNA-AS1 過(guò)表達(dá)載體（pcDNAPCNA-AS1）、空載體（pcDNA）轉(zhuǎn)染至Hela細(xì)胞，具體轉(zhuǎn)染步驟參照LipofectamineTM 2000 試劑盒說(shuō)明書(shū)。轉(zhuǎn)染6h 后，更換為常規(guī)培養(yǎng)基。繼續(xù)培養(yǎng)至48h，收集細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 細(xì)胞分組 Hela細(xì)胞分為對(duì)照組（Con 組）、低劑量褐藻多糖硫酸酯組（Fucoidan-L 組）、中劑量褐藻多糖硫酸酯組（Fucoidan-M 組）和高劑量褐藻多糖硫酸酯組(Fucoidan-H 組)。Con 組細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h；Fucoidan-L 組、Fucoidan-M 組和Fucoidan-H 組細(xì)胞分別用含0.2、0.4、0.8 mg/ml[9]褐藻多糖硫酸酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h。轉(zhuǎn)染si-PCNAAS1、si-NC的細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，分別記為si-PCNA-AS1 組和si-NC 組。轉(zhuǎn)染pcDNA-PCNAAS1、pcDNA的細(xì)胞用含0.8mg/ml 褐藻多糖硫酸酯的培養(yǎng)基培養(yǎng)24h，分別記為Fucoidan+pcDNAPCNA-AS1 組和Fucoidan+pcDNA 組。

1.2.3 細(xì)胞計(jì)數(shù)試劑盒-8（CCK-8）檢測(cè)細(xì)胞增殖Hela細(xì)胞及轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞，以每孔5×103個(gè)接種于96 孔板中。按照1.2.2 分組處理，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h 后,每孔加入10μl CCK-8 試劑，繼續(xù)孵育4h,酶標(biāo)儀450nm 處測(cè)定吸光度值（absorbance，A），并計(jì)算細(xì)胞抑制率。細(xì)胞抑制率（%）=（A對(duì)照組-A 實(shí)驗(yàn)組）/A對(duì)照組×100%。

1.2.4 流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡 Hela細(xì)胞及轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞，以每孔2.5×104個(gè)接種于24 孔板中。按照1.2.2 分組處理，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。取1.0×106個(gè)細(xì)胞，適量磷酸鹽緩沖液（phosphate buffered saline，PBS）清洗2 次，1500r/min 離心5min，吸棄PBS。加入500μl 結(jié)合緩沖液，移液器輕輕吹打，混懸細(xì)胞后加入10μl Annexin V-FITC，室溫避光孵育10min。再加入5μl PI，混勻，室溫避光孵育10 min 后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞凋亡。

1.2.5 Western Blot 法檢測(cè)細(xì)胞中CyclinD1、p21、Bax和Bcl-2蛋白表達(dá) Hela細(xì)胞及轉(zhuǎn)然后的細(xì)胞，以每孔2.5×104個(gè)接種于24 孔板中。按照1.2.2分組處理，每組設(shè)置3 個(gè)復(fù)孔。培養(yǎng)24h 后，吸棄培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化，收集細(xì)胞。RIPA細(xì)胞裂解液提取細(xì)胞中總蛋白，BCA 法測(cè)定蛋白含量后進(jìn)行定量。取適量蛋白溶液,100℃煮沸5min。取30μg蛋白進(jìn)行上樣，行10 %十二烷基磺酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳（SDS-PAGE）。蛋白分離后，電轉(zhuǎn)移至聚偏乙烯二氟（PVDF）膜，于5 %脫脂牛奶中封閉2h。分別加入CyclinD1（稀釋比1:1000）、p21（稀釋比1:1000）、Bax（稀釋比1:8000）、Bcl-2（稀釋比1:8000）和GAPDH（稀釋比1:1000）抗體，4℃孵育過(guò)夜。TBST 洗膜3 次，每次5min。加入辣根過(guò)氧化酶標(biāo)記的二抗（稀釋比1:3000），37℃孵育1h。TBST洗膜3 次，每次5min。加入ELC 顯影液，避光顯影。凝膠成像系統(tǒng)曝光拍照后，Image J 軟件分析蛋白條帶灰度值。以GAPDH 為內(nèi)參，計(jì)算目的蛋白的相對(duì)表達(dá)水平。

1.2.6 實(shí)時(shí)熒光定量PCR（RT-qPCR）檢測(cè)PCNAAS1基因表達(dá) Trizol 試劑提取細(xì)胞中總RNA，微量核算儀檢測(cè)RNA的純度和濃度。參照逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，將RNA 合成為cDNA。以cDNA 為模板，進(jìn)行PCR 擴(kuò)增。擴(kuò)增程序：95℃預(yù)變性5min，95℃變性10s，60℃退火30s，72℃延伸30s,共進(jìn)行35 個(gè)循環(huán)。PCNA-AS1 正向引物5'-GT AGGTGTCGAAGCCCTCAG-3'，反向引物5'-GAAGCCGAAA CCAGCTAGAC-3'；GAPDH 正向引 物5'-TCCCTCAAGATTGCTAGCAA-3'，反向引物5'-AGATCCACAACGGA TACATT-3'。以GAPDH 為內(nèi)參，2－△△Ct法計(jì)算PCNA-AS1基因的相對(duì)表達(dá)水平。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 利用SPSS.22.0 軟件分析實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。符合正態(tài)分布的計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（）表示。兩組間比較采用獨(dú)立樣本t 檢驗(yàn)；多組間比較采用單因素方差分析，進(jìn)一步兩兩比較采用SNK-q 檢驗(yàn)。P<0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 褐藻多糖硫酸酯對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖的影響與Con 組比較，不同劑量Fucoidan 組細(xì)胞抑制率顯著升高（P<0.05），CyclinD1蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05),p21蛋白表達(dá)水平顯著升高(P<0.05),且不同劑量Fucoidan 組間兩兩比較各檢測(cè)指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖1和表1。

圖1 Western Blot 檢測(cè)褐藻多糖硫酸酯作用Hela細(xì)胞后CyclinD1和p21蛋白表達(dá)

表1 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖及CyclinD1和p21蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

表1 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖及CyclinD1和p21蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan-L 組比較，#P<0.05；與Fucoidan-M 組比較，&P<0.05。

2.2 褐藻多糖硫酸酯對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞凋亡的影響與Con 組比較，不同劑量Fucoidan 組細(xì)胞凋亡率顯著升高（P<0.05），Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），且不同劑量Fucoidan 組間兩兩比較各檢測(cè)指標(biāo)差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)圖2和表2。

表2 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

表2 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan-L 組比較，#P<0.05；與Fucoidan-M 組比較，&P<0.05。

圖2 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞凋亡及Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)的影響

2.3 褐藻多糖硫酸酯對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)的影響與Con 組比較,不同劑量Fucoidan 組細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）,且不同劑量Fucoidan 組間兩兩比較PCNA-AS1 差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P<0.05）。見(jiàn)表3。

表3 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)的影響（，n=9）

表3 褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan-L 組比較，#P<0.05；與Fucoidan-M 組比較，&P<0.05。

2.4 干擾PCNA-AS1表達(dá)對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的影響 si-PCNA-AS1 組Hela細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)水平顯著低于si-NC 組（P<0.05），表明PCNA-AS1 小干擾RNA 轉(zhuǎn)染成功，細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)受到干擾。與si-NC 組比較，si-PCNA-AS1 組Hela細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著升高（P<0.05），CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05），p21和Bax蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05）。見(jiàn)圖3和表4。

表4 干擾PCNA-AS1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

表4 干擾PCNA-AS1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

注：與si-NC 組比較，*P<0.05。

圖3 干擾PCNA-AS1表達(dá)對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

2.5 PCNA-AS1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)宮頸癌Hela細(xì)胞增殖和凋亡的作用與Fucoidan+pcDNA 組比較，F(xiàn)ucoidan+pcDNA-PCNA-AS1 組Hela細(xì)胞抑制率、凋亡率顯著降低（P<0.05），CyclinD1和Bcl-2蛋白表達(dá)水平顯著升高（P<0.05），p21和Bax蛋白表達(dá)水平顯著降低（P<0.05）。見(jiàn)圖4和表5。

表5 PCNA-AS1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

表5 PCNA-AS1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響（，n=9）

注：與Con 組比較，*P<0.05；與Fucoidan+pcDNA 組比較，#P<0.05。

圖4 PCNA-AS1 過(guò)表達(dá)逆轉(zhuǎn)褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖、凋亡及相關(guān)蛋白表達(dá)的影響

3 討論

褐藻多糖硫酸酯又被稱為褐藻糖膠或巖藻聚糖，是一種水溶性雜多糖。研究顯示，褐藻多糖硫酸酯可在體外抑制口腔鱗狀細(xì)胞癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，并促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡，這與其上調(diào)細(xì)胞中circFLNA表達(dá)有關(guān)[10]。褐藻多糖硫酸酯可抑制乳腺癌MCF-7細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力，其可能通過(guò)抑制上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化（EMT）過(guò)程發(fā)揮作用，可能是人類乳腺癌的潛在治療藥物[11]。本研究顯示不同濃度的褐藻多糖硫酸酯可顯著抑制Hela細(xì)胞增殖，并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示褐藻多糖硫酸酯具有抗宮頸癌的作用。CyclinD1 是細(xì)胞周期相關(guān)蛋白，其表達(dá)升高促進(jìn)細(xì)胞周期進(jìn)程[12]。p21是腫瘤抑制因子，可與細(xì)胞周期相關(guān)蛋白形成復(fù)合物阻滯細(xì)胞周期進(jìn)程[13]。本研究顯示，褐藻多糖硫酸酯可降低Hela細(xì)胞中CyclinD1蛋白表達(dá)，促進(jìn)p21蛋白表達(dá)，提示褐藻多糖硫酸酯可能通過(guò)調(diào)控細(xì)胞周期相關(guān)蛋白的表達(dá)抑制細(xì)胞增殖。Bax為促凋亡蛋白，Bcl-2 為抗凋亡蛋白,二者參與細(xì)胞凋亡[14]。本研究顯示,褐藻多糖硫酸酯可降低Hela細(xì)胞中Bcl-2蛋白表達(dá)，促進(jìn)Bax蛋白表達(dá)，提示褐藻多糖硫酸酯誘導(dǎo)Hela細(xì)胞凋亡與調(diào)控Bax和Bcl-2蛋白表達(dá)有關(guān)。

本研究還顯示，褐藻多糖硫酸酯作用Hela細(xì)胞后，細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)水平顯著降低，提示PCNA-AS1 可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展過(guò)程。PCNA-AS1 是近年來(lái)新發(fā)的一種lncRNA，與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)。研究顯示，結(jié)直腸癌組織中PCNA-AS1表達(dá)升高，其高表達(dá)與腫瘤侵襲和TNM 分期密切相關(guān)，可能是診斷結(jié)直腸癌的潛在腫瘤生物標(biāo)志物[15]；PCNA-AS1在非小細(xì)胞肺癌（NSCLC）組織和細(xì)胞系中表達(dá)上調(diào)，過(guò)表達(dá)PCNA-AS1 可促進(jìn)NSCLC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，干擾PCNA-AS1表達(dá)則抑制NSCLC細(xì)胞增殖和細(xì)胞周期進(jìn)程，其可以作為NSCLC的治療靶標(biāo)[16,17]。目前，PCNA-AS1對(duì)宮頸癌細(xì)胞增殖和凋亡的影響還未知。本研究通過(guò)轉(zhuǎn)染PCNA-AS1 小干擾RNA 干擾Hela細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)后，細(xì)胞增殖能力降低，凋亡家居，說(shuō)明干擾PCNA-AS1表達(dá)可抑制Hela細(xì)胞增殖并誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，提示PCNA-AS1 可能也是潛在治療宮頸癌的分子靶點(diǎn)。為了進(jìn)一步探討褐藻多糖硫酸酯發(fā)揮抗宮頸癌作用的分子機(jī)制，本研究使用褐藻多糖硫酸酯作用PCNA-AS1 過(guò)表達(dá)的Hela細(xì)胞，結(jié)果顯示，與只使用褐藻多糖硫酸酯干預(yù)的細(xì)胞比較，Hela細(xì)胞活性顯著升高，凋亡率顯著降低，說(shuō)明過(guò)表達(dá)PCNAAS1 降低了褐藻多糖硫酸酯對(duì)Hela細(xì)胞增殖的抑制作用及凋亡促進(jìn)作用，提示褐藻多糖硫酸酯通過(guò)下調(diào)PCNA-AS1表達(dá)發(fā)揮抗宮頸癌作用。

綜上所述,褐藻多糖硫酸酯可抑制宮頸癌細(xì)胞增殖，并促進(jìn)細(xì)胞凋亡，發(fā)揮抗宮頸癌作用，其作用機(jī)制可能與下調(diào)細(xì)胞中PCNA-AS1表達(dá)有關(guān)。