超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定小麥中4種真菌毒素

胡莎 袁夢 葛文靜 林翠蘋 于業(yè)志

摘 要：本文旨在建立同時測定小麥中脫氧雪腐鐮刀菌烯醇、玉米赤霉烯酮、黃曲霉毒素B1和赭曲霉毒素A 4種真菌毒素的超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜的分析方法。以小麥為研究對象，分樣制粉后，經(jīng)乙腈/水振蕩提取后過濾，濾液中加入乙酸混勻，通過MycoSpinTM400多功能凈化柱，以1%乙酸溶液+5 mmol/L乙酸銨水溶液-甲醇為流動相，多反應(yīng)監(jiān)測模式上機檢測。結(jié)果顯示，4種真菌毒素在各自的濃度范圍內(nèi)均有良好的線性關(guān)系（r2≥0.996 2），3水平加標回收率在86.6%～110.1%，相對標準偏差在3.0%～18.7%，具有良好的精密度。該方法具有靈敏度高、準確、高效的優(yōu)點，適用于小麥中4種真菌毒素同時前處理檢測。

關(guān)鍵詞：超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜;小麥;真菌毒素

真菌毒素污染是威脅糧食安全的重要因素，糧食在種植、加工、儲存及流通等環(huán)節(jié)中可能被真菌毒素污染[1]，最新發(fā)布的《食品安全國家標準 食品中真菌毒素限量》（GB 2761—2017）規(guī)定了谷物及其制品中對黃曲霉毒素B1（Aflatoxin B1，AFT B1）、脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）、赭曲霉毒素A（Orchatoxin A，OTA）及玉米赤霉烯酮（Zearalenone，ZEN）的限量指標[2-3]，這4種真菌毒素是目前為止認為可能對人們的健康構(gòu)成較大風(fēng)險的[3-7]?，F(xiàn)在國內(nèi)外對糧油產(chǎn)品中真菌毒素的檢測標準方法一般常見的有膠體金快速檢測法[8-9]、薄層色譜法[10]、酶聯(lián)免疫法[11]、高效液相色譜法[12]及液相液質(zhì)聯(lián)用法[13]。

本文旨在建立多功能柱凈化、超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法同時測定小麥中DON、OTA、AFT B1和ZEN共4種真菌毒素的含量。

1 材料與方法

1.1 儀器與試劑

Agilent超高效液相色譜串聯(lián)質(zhì)譜聯(lián)用儀（UPLC-QQQ 1290-6460，安捷倫科技有限公司）;離心機（Sartorius sigma 3-18k）振蕩器（Heidolph Multi Reax）;電子天平（Sartorius）;MycoSpinTM 400 Multitoxin凈化柱（Romer Labs公司）;微型聚四氟乙烯濾膜（0.22 μm）。

超純水（娃哈哈）;乙腈（色譜純）、乙酸（色譜純）、乙酸銨（色譜純）、甲醇（色譜純），德國merck公司;標準溶液DON（100.6 mg/L）、ZEN（100.4 mg/L）、AFT B1（100.3 mg/L）、OTA（100.1 mg/L），Pribolab公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品處理

稱取25 g（精確至0.001 g）樣品于250 mL具塞三角瓶中，加入100 mL乙腈/水（50/50，V/V），放置于震蕩器中混合90 min，靜置1 min后過濾，吸取10 mL濾液于50 mL聚丙烯離心管中，并加入500 μL乙酸混勻，從混合液中移取750 μL至MycoSpinTM 400凈化柱，蓋緊凈化柱振蕩混合

1 min，凈化柱底端將凈化柱放入離心管中，轉(zhuǎn)速10 000 r/min離心30 s，取上清液過0.22 μm濾膜于進樣瓶中，待上機檢測。

1.2.2 溶液的配制

（1）混合標準工作液的配制。將4種真菌毒素標準溶液依次稀釋成DON（100 μg/mL）、ZEN（100 μg/mL）、AFT B1（4.0 μg/mL）、OTA（2 μg/mL）的單標儲備液，分別吸取1 500 μL、200 μL、250 μL、1 000 μL的DON、ZEN、OTA、AFT B1單標儲備液于10 mL容量瓶中，用水定容至刻度，配制成濃度分別為15.0 μg/mL、2.0 μg/mL、0.1 μg/mL、0.2 μg/mL的混合標準工作液。

（2）標準溶液配制。分別準確移取25 μL、50 μL、

100 μL、250 μL、500 μL和1 000 μL混標溶液于10 mL容量瓶中，用標準曲線溶劑（乙腈-水-乙酸混合液35.0︰64.5︰0.5，體積比）定容至刻度，各標準具體濃度見表1。

1.2.3 色譜分離條件

色譜柱C18柱（1.8 μm，100 mm×3.0 mm）;柱溫：35 ℃;進樣體積：4 μL;流動相A：1%乙酸溶液+5 mmol/L乙酸銨水溶液;流動相B：甲醇，流動相梯度見表2。

1.2.4 質(zhì)譜條件

離子源：電噴霧離子源;毛細管電壓：4 kV（+）3.5 kV（-）;干燥氣溫度：350 ℃;霧化氣電壓：40 psi;干燥氣流量：10 L/min;碰撞氣：氮氣;掃描模式：多反應(yīng)監(jiān)測MRM;駐留時間：30 ms;

2 結(jié)果與分析

2.1 液相色譜條件的優(yōu)化

2.1.1 流動相的優(yōu)化

流動相對檢出目標物質(zhì)的分離度、響應(yīng)值、峰型及離子化效率都有影響，根據(jù)現(xiàn)有的檢測這4種毒素的檢測標準及相關(guān)文獻顯示流動相一般采用甲酸水溶液/乙腈，乙腈/乙酸銨，乙腈/甲酸/甲酸銨，乙腈/水，乙酸銨/甲醇-乙腈，結(jié)合需檢出的這4種真菌毒素的結(jié)構(gòu)特性，一般在ESI正負離子模式下[M+H]+、[M-H]-、[M-CH3COO]-、[M+NH4]+離子峰形式出現(xiàn)，本實驗選定流動相為1%乙酸溶液+5 mmol/L乙酸銨水溶液/甲醇對4種真菌毒素能夠有很好的分離效果。

2.1.2 色譜柱的優(yōu)化

本實驗比較了兩種色譜柱Eclispse Plus C18（2.1mm×50 mm，1.8 μm）和ZORBAX Eclipse Plus C18（3.0 mm×100 mm，1.8 μm）對4種真菌毒素的分離效果，同樣的色譜條件下后一種色譜柱分離效果更佳。

2.2 質(zhì)譜條件的優(yōu)化

2.2.1 母離子的選擇和碎裂電壓的優(yōu)化

將真菌毒素單標溶液直接連接質(zhì)譜進樣1 μL，分別在正負離子模式下進行MS2 Scan全掃描，確定各毒素母離子質(zhì)量數(shù)。然后進行MS2 SIM選擇離子監(jiān)測，優(yōu)化碎裂電壓。

2.2.2 子離子的選擇和碰撞能量的優(yōu)化

設(shè)置母離子質(zhì)量數(shù)和MS2的掃描范圍，進行Product Ion Scan 子離子掃描，將響應(yīng)最高的確定為定量離子，次之確定為定性離子，并優(yōu)化碰撞能量CE。優(yōu)化完成后進行MRM多反應(yīng)監(jiān)測，主要參數(shù)見表3。

2.3 線性范圍與檢出限

由表4可知，4種真菌毒素在標準曲線溶液濃度范圍內(nèi)有較好的線性關(guān)系，以3倍和10倍信噪比分別確定目標物的檢出限和定量限。

2.4 回收率與精密度

在空白樣品中添加低、中、高3個不同濃度的混合標準溶液，3水平重復(fù)測定6次，加標回收率、相對標準偏差結(jié)果見表5。3水平加標回收率在86.6%～110.1%，相對標準偏差在3.0%～18.7%，由此可見，方法具有良好的精密度。

3 結(jié)論

本文采用乙腈水提取小麥中4種常見真菌毒素，MycoSpinTM400 Multitoxin 凈化柱凈化，能有效的去除小麥基質(zhì)中的雜質(zhì)，減少基質(zhì)效應(yīng)，采用三重四極桿液質(zhì)聯(lián)用MRM模式進行檢測，該方法高效快捷、操作簡單、回收率高，精密度與準確度好，適合同時測定小麥中4種真菌毒素。

參考文獻

[1]蘇福榮，王松雪，孫輝，等.國內(nèi)外糧食中真菌毒素限量標準制定的現(xiàn)狀與分析[J].糧油食品科技，2007，15（6）：57-59.

[2]國家衛(wèi)生和計劃生育委員會，國家食品藥品監(jiān)督管理總局.食品中真菌毒素限量：GB 2761—2017[S].北京：中國標準出版社，2017.

[3]DRAGAN R M，MARIJA ?，TATJANA B.Real and perceived risks for mycotoxin contamination in foods and feeds：challenges for food safety control[J].Toxins，2010，2（4）：572-592.

[4]BLAKE R R，MUSTAFA I S.Aflatoxin B1：A review on metabolism，toxicity，occurrence in food，occupational exposure， and detoxification methods[J].Food and Chemical Toxicology，2018，124：81-100.

[5]ANNIE P，RICHARD A M.Ochratoxin A：An overview on toxicity and carcinogenicity in animals and humans[J].Molecular Nutrition and Food Research，2007，51（9）：1192.

[6]JAMES J P.Deoxynivalenol：mechanisms of action，human exposure，and toxicological relevance[J].Archives of Toxicology，2010，84（9）：663-679.

[7]KAROLINA K，DOMINIKA E，AGNIESZKA W.Zearalenone as an endocrine disruptor in humans[J].Environmental Toxicology and Pharmacology，2016，48：141-149.

[8]曹德康，蘇建忠，張瑛，等.膠體金免疫層析技術(shù)快速檢測谷物中3種真菌毒素的研究[J].中國食品衛(wèi)生雜志，2017，29（3）：306-312.

[9]陳明偉，王巖，張永君，等.糧食中真菌毒素和快速定量檢測方法的探討[J].糧食與食品工業(yè)，2020，27（4）：69-71.

[10]馮莉.薄層色譜法檢測玉米中黃曲霉毒素B1[J].現(xiàn)代畜牧科技，2018（8）：24.

[11]劉菲，王莉娜，胡俊.酶聯(lián)免疫吸附篩法測定大米和大麥中黃曲霉毒素B1的含量[J].2018，6（69）：14-18.

[12]BASCAR?N V，ROJAS D，CHOUCI?O P，et al.Analysis of ochratoxin A in milk after direct immunoaffinity column clean-up by high-performance liquid chromatograp-by with fluorescence detection[J].Journal of chromatography A，2007，1167（1）：95-101.

[13]朱蕓，雒婉霞，趙清榮，等.液質(zhì)聯(lián)用同位素內(nèi)標法同時測定3類小麥終產(chǎn)品中4種B類單端孢烯霉族類真菌毒素[J].中國衛(wèi)生檢驗雜志，2017，27（13）：1863-1866.