腸桿菌科細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類的耐藥性及16S rRNA甲基化酶基因的檢測(cè)研究

王 文， 王 亮， 陶 佳， 李 剛， 賈 偉

當(dāng)前革蘭陰性桿菌的耐藥性日趨嚴(yán)重，尤其是多重耐藥和泛耐藥菌株的出現(xiàn)已成為全球關(guān)注的焦點(diǎn)。氨基糖苷類抗菌藥物因其抗菌譜廣、抗菌活性強(qiáng)，被用于抗耐藥革蘭陰性菌感染的臨床治療，尤其是腸桿菌科細(xì)菌所致的感染，已經(jīng)成為聯(lián)合用藥的重要選擇之一[1]。但16S rRNA甲基化酶的出現(xiàn)和擴(kuò)散，導(dǎo)致了細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類抗菌藥物高水平耐藥，影響了其臨床抗感染治療。本研究對(duì)寧夏醫(yī)科大學(xué)總醫(yī)院2017年分離的氨基糖苷類耐藥腸桿菌科細(xì)菌的16S rRNA甲基化酶基因進(jìn)行篩查，并對(duì)耐藥情況進(jìn)行研究。

1 材料與方法

1.1 菌株來源

收集我院2017年1月1日—12月31日臨床診斷為各種包括呼吸道、腹腔、尿路、血流和皮膚軟組織等感染分離的非重復(fù)腸桿菌科細(xì)菌142株，其中包含對(duì)阿米卡星耐藥的腸桿菌科細(xì)菌72株（大腸埃希菌37株、肺炎克雷伯菌35株），對(duì)阿米卡星敏感的腸桿菌科細(xì)菌70株（大腸埃希菌32株、肺炎克雷伯菌38株），稱為氨基糖苷類耐藥/敏感腸桿菌科細(xì)菌。質(zhì)控菌株為大腸埃希菌ATCC 25922，銅綠假單胞菌ATCC 27853，購(gòu)自上海漢尼生物技術(shù)有限公司。

1.2 儀器和試劑

采用法國(guó)生物梅里埃全自動(dòng)細(xì)菌分析儀VITEK 2-Compact對(duì)細(xì)菌進(jìn)行鑒定，儀器配套藥敏卡GN04初篩阿米卡星耐藥（MIC≥64 mg/L），肉湯微量稀釋法進(jìn)行藥敏復(fù)核，按照2017年美國(guó)臨床和實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（CLSI）標(biāo)準(zhǔn)判斷結(jié)果。

1.3 基因擴(kuò)增和測(cè)序

將142株細(xì)菌分純培養(yǎng)后，用煮沸法提取細(xì)菌DNA[2]。取1 μL提取物做模板，對(duì)16S rRNA甲基化酶基因（armA、rmtA、rmtB、rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA） 進(jìn) 行 PCR擴(kuò)增，將陽(yáng)性擴(kuò)增產(chǎn)物送上海生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)序，所得序列用BLAST軟件（https:www.ncbi.nlm.nih.gov/）分別進(jìn)行比對(duì)。引物見表1， 具體反應(yīng)條件參見文獻(xiàn)[2-7]。PCR 產(chǎn)物作1.5%瓊脂糖凝膠電泳，電泳結(jié)束后經(jīng)溴化乙啶染液染色15 min，在紫外凝膠成像儀中觀察并記錄結(jié)果。

表1 16S rRNA甲基化酶基因引物序列Table 1 Primers of 16S rRNA methylase genes used in this study

1.4 統(tǒng)計(jì)

采用WHONET 5.6軟件對(duì)細(xì)菌的標(biāo)本來源、科室分布、藥敏進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果

2.1 病例和標(biāo)本的分布

142株腸桿菌科細(xì)菌主要收集于臨床明確診斷為呼吸道感染（31.7 %）、腹腔感染（23.9%）、尿路感染（23.3%）、血流感染（7.7%）等病例分離的菌株；大部分分離自痰液（31.0 %）、尿液（23.3%）、分泌物（11.3%）、血液（7.7%）等標(biāo)本，見表2。142例患者中男79例，女63例；體溫為36.0～40.0℃；WBC（2.22～54.86）×109/L；診斷為呼吸道感染的45例患者的X攝片顯示肺部有炎性浸潤(rùn)性改變、肺部積液等。68 例大腸埃希菌感染患者多見于尿路和腹腔感染，74例肺炎克雷伯菌感染者多見于呼吸道感染，分布較大腸埃希菌集中。氨基糖苷類耐藥株和敏感株所致感染分別占50.7%（72/142）和 49.3% （70/142），見表2。

表2 （續(xù)）Table 2（continued）

表2 142株腸桿菌科細(xì)菌感染患者相關(guān)的臨床信息Table 2 Clinical data of the patients associated with 142 strains of Enterobacteriaceae

2.2 細(xì)菌的耐藥性

72株氨基糖苷類耐藥腸桿菌科細(xì)菌對(duì)阿米卡星和慶大霉素均耐藥，對(duì)頭孢菌素類、氟喹諾酮類的耐藥率均大于80%，對(duì)酶抑制復(fù)合制劑頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦的耐藥率在50%以上，對(duì)替加環(huán)素、頭孢他啶-阿維巴坦的耐藥率小于10%；其中37株大腸埃希菌對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率分別為29.7%、32.4%、37.8%；35株肺炎克雷伯菌對(duì)亞胺培南、美羅培南、厄他培南的耐藥率均為40.0%。70株氨基糖苷類敏感的腸桿菌科細(xì)菌對(duì)阿米卡星、慶大霉素、亞胺培南、美羅培南、厄他培南、替加環(huán)素、頭孢他啶-阿維巴坦、哌拉西林-他唑巴坦均敏感。見表3。

表3 142株腸桿菌科細(xì)菌對(duì)抗菌藥物的耐藥性和敏感性Table 3 Antimicrobial susceptibility of 142 strains of Enterobacteriaceae to antimicrobial agents

2.3 16S rRNA甲基化酶基因檢測(cè)

經(jīng)PCR檢測(cè)和DNA測(cè)序，共檢出71株16S rRNA甲基化酶基因陽(yáng)性菌株，占總菌數(shù)的50.0%（71/142），在氨基糖苷類耐藥株中的陽(yáng)性率 為 98.6%（71/72）。rmtC、rmtD、rmtE、rmtF、rmtG、rmtH、npmA均未檢測(cè)到，基因分布見表2，擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖見圖1。

圖1 16S rRNA甲基化酶基因擴(kuò)增產(chǎn)物電泳圖Figure 1 Electrophoresis map for PCR products of 16S rRNA methylase genes

3 討論

氨基糖苷類抗生素因其抗菌譜廣、高效且濃度依賴性的快速殺菌特點(diǎn)，成為臨床治療革蘭陰性桿菌感染有效的藥物之一。但隨著其廣泛應(yīng)用，耐藥現(xiàn)象也隨之而來。細(xì)菌對(duì)氨基糖苷類藥物耐藥的主要機(jī)制是產(chǎn)生氨基糖苷類修飾酶AME以及16S rRNA甲基化酶[8]，自2003年法國(guó)報(bào)道了產(chǎn) 16S rRNA甲基化酶的肺炎克雷伯菌后，多個(gè)國(guó)家均在革蘭陰性桿菌中發(fā)現(xiàn)16S rRNA 甲基化酶[9-10]。

本組資料顯示，對(duì)氨基糖苷類抗生素耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌對(duì)頭孢菌素、氟喹諾酮類、氨曲南的耐藥率均≥77.1%；對(duì)頭孢哌酮-舒巴坦、哌拉西林-他唑巴坦等β內(nèi)酰酶抑制劑復(fù)合制劑的耐藥率≥51.4 %；還顯示氨基糖苷類耐藥的肺炎克雷伯菌對(duì)3種受試的碳青霉烯類藥物的耐藥率均為40.0%，但氨基糖苷類耐藥的大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類藥物的耐藥率為29.7%～37.8%，與吳瓊等[11]報(bào)道的均敏感不一致。由此可見氨基糖苷類耐藥的大腸埃希菌和肺炎克雷伯菌如同臨床上發(fā)現(xiàn)的ESBL等菌株一樣，亦是一類多重耐藥菌株，或?yàn)閺V泛耐藥菌株，需引起重視。所幸，替加環(huán)素及頭孢他啶-阿維巴坦對(duì)這兩種氨基糖苷類耐藥的腸桿科細(xì)菌都有較好的抗菌活性，細(xì)菌的敏感率均≥94.3%。相比較氨基糖苷類耐藥株，氨基糖苷類敏感肺炎克雷伯菌對(duì)多數(shù)受試抗菌藥物均較為敏感，細(xì)菌耐藥率均≤15.4%；但氨基糖苷類敏感大腸埃希菌對(duì)第三、第四代頭孢菌素和氨曲南的耐藥率≥25.8%，對(duì)氟喹諾酮類抗菌藥物環(huán)丙沙星和左氧氟沙星的耐藥率為58.1%。因此在抗感染治療時(shí)須依據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果報(bào)告慎重選用抗菌藥物。

本研究中， 儀器法檢測(cè)到4株對(duì)阿米卡星耐藥的大腸埃希菌，而慶大霉素對(duì)這4株菌株的MIC分別為8、8、≤1、≤1 mg/L，為一類慶大霉素中介/敏感菌株；經(jīng)阿米卡星和慶大霉素肉湯稀釋法復(fù)核后，結(jié)果顯示此4株細(xì)菌均對(duì)阿米卡星和慶大霉素耐藥，且都攜帶rmtB基因，證實(shí)儀器法檢測(cè)結(jié)果為慶大霉素假敏感。先前Ko等[12]于2017年也有過類似報(bào)道，稱VITEK-2 自動(dòng)化系統(tǒng)對(duì)氨基糖苷類高水平耐藥可能被錯(cuò)誤地檢測(cè)為敏感。此類不一致的藥敏試驗(yàn)現(xiàn)象值得引起臨床微生物實(shí)驗(yàn)室常規(guī)藥敏檢測(cè)的重視。

據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道，16S rRNA甲基化酶基因的分布因地域不同而有所差異。在歐洲以armA為主，在北美洲以armA和rmtB為主，拉丁美洲以rmtD為主[13]；在國(guó)內(nèi)，如廣州、長(zhǎng)沙等南方地區(qū)以armA為主[14-15]；上海、江浙地區(qū)以rmtB為主[11,16]。本組資料顯示，16S rRNA甲基化酶基因以rmtB為主，占76.1%（54/71），armA次之，為19.7%（14/71），與上海、江浙地區(qū)報(bào)道相似，基因分布的差異可能與菌株的來源及用藥習(xí)慣的差異有關(guān)。本組資料中，發(fā)現(xiàn)1株rmtB和armA同時(shí)擴(kuò)增陽(yáng)性菌株以及2株rmtA陽(yáng)性菌株，國(guó)內(nèi)未見rmtA基因存在于腸桿菌科細(xì)菌中的報(bào)道。1株耐藥大腸埃希菌所有基因擴(kuò)增均陰性，推測(cè)可能存在其他未檢測(cè)到的耐藥機(jī)制。在70株氨基糖苷類敏感的腸桿菌科細(xì)菌中均未檢測(cè)到16S rRNA甲基化酶基因，此與2010年余方友等[16]國(guó)內(nèi)報(bào)道的研究結(jié)果一致。Joel等[17]2015年曾報(bào)道發(fā)現(xiàn)16S rRNA甲基化酶基因和碳青霉烯酶基因可存在于同一菌株中。本組資料亦顯示有近40%的氨基糖苷類耐藥的肺炎克雷伯菌和大腸埃希菌對(duì)碳青霉烯類耐藥，但本研究未對(duì)該類耐藥細(xì)菌的碳青霉烯酶基因進(jìn)行檢測(cè)，有待進(jìn)一步研究。

本組資料雖然沒有過多的除阿米卡星和慶大霉素之外的其他氨基糖苷類抗菌藥物的研究和相關(guān)傳播機(jī)制等研究，但文獻(xiàn)報(bào)道，16S rRNA甲基化酶與氨基糖苷類高濃度耐藥存在相關(guān)性，且16S rRNA甲基化酶基因位于轉(zhuǎn)座子、質(zhì)粒等可移動(dòng)基因元件中，能突破地域和種屬界限，廣泛進(jìn)行水平傳播和克隆傳播[18]，因此應(yīng)對(duì)16S rRNA甲基化酶基因進(jìn)行早期篩查和監(jiān)控，并采取措施防止耐藥菌株傳播。有待擴(kuò)大樣本量，繼續(xù)調(diào)查本地區(qū)16S rRNA甲基化酶基因的流行情況，研究其耐藥基因的傳遞機(jī)制，為控制醫(yī)院感染和臨床抗感染治療提供科學(xué)依據(jù)。