細(xì)菌分型方法的研究進(jìn)展

吳雨辰， 胡燕燕， 張 嶸

細(xì)菌分型是區(qū)分菌株并研究其相關(guān)性的手段，是疫情調(diào)查、監(jiān)測(cè)和系統(tǒng)發(fā)育研究的重要工具。早期的分型技術(shù)基于被測(cè)細(xì)菌的表型，如抗生素敏感性（耐藥譜分型）、對(duì)噬菌體的敏感性（噬菌體分型）和表面抗原（血清分型）等進(jìn)行區(qū)分。隨著分子生物學(xué)的進(jìn)步，基于DNA的分型方法得到了普及。相比于檢測(cè)表型，DNA的穩(wěn)定性使得測(cè)定結(jié)果具有高度的可重復(fù)性。后期質(zhì)譜與振動(dòng)光譜的發(fā)展使得檢測(cè)更為快速和簡(jiǎn)便。本文將對(duì)常用細(xì)菌分型技術(shù)原理、應(yīng)用以及優(yōu)缺點(diǎn)進(jìn)行簡(jiǎn)要闡述。

1 分子生物學(xué)技術(shù)

1.1 脈沖場(chǎng)凝膠電泳（PFGE）

PFGE技術(shù)主要原理是用適當(dāng)?shù)暮怂醿?nèi)切酶對(duì)細(xì)菌的基因組序列進(jìn)行消化[1]，產(chǎn)生若干限制性片段，在脈沖電場(chǎng)中將大小片段分離，并進(jìn)行應(yīng)用分析。因其重復(fù)性好、分辨率高、結(jié)果穩(wěn)定且易于標(biāo)準(zhǔn)化，被認(rèn)為是細(xì)菌分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”[2]。在耐萬(wàn)古霉素腸球菌暴發(fā)的流行病學(xué)調(diào)查中，PFGE相比于單核苷酸多態(tài)性（single nucleotide polymorphism, SNP）分析和基質(zhì)輔助激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜法（matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry,MALDI-TOF MS）分析有著更高的分辨率[3]。在測(cè)定布魯菌分離株的遺傳相似性方面也比PCR-限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（restriction fragment length polymorphism，RFLP）法更優(yōu)[4]。目前PFGE已廣泛應(yīng)用于流行病學(xué)、微生物學(xué)和進(jìn)化生物學(xué)的研究，同時(shí)促進(jìn)了細(xì)菌分型的PFGE協(xié)議標(biāo)準(zhǔn)化。CDC已發(fā)布統(tǒng)一的PFGE協(xié)議（https://www.cdc.gov/hai/pdfs/labsettings/unified_pfge_protocol.pdf），用于對(duì)革蘭陽(yáng)性細(xì)菌進(jìn)行分型。國(guó)際食源性疾病監(jiān)測(cè)網(wǎng)絡(luò)PulseNet International在其網(wǎng)站（http://www.pulsenetinternational.org/protocols/）上發(fā)布了重要食源性病原體的PFGE協(xié)議，并在CDC PulseNet網(wǎng)站上發(fā)布了更新版本（https://www.cdc.gov/pulsenet/pathogens/pfge.html）[5]。 不 過 PFGE實(shí)驗(yàn)周期長(zhǎng)，操作要求高，并且缺乏對(duì)幾乎相同大小條帶的分辨能力[6]。

1.2 限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性（RFLP）

利用限制性內(nèi)切酶（restriction endonuclease）切割目的基因片段，再利用標(biāo)記探針對(duì)其中部分片段進(jìn)行Southern印跡分析，就可以通過簡(jiǎn)化的數(shù)據(jù)進(jìn)行菌株的區(qū)分并分析遺傳相關(guān)性。插入序列（insertion sequences，IS）-RFLP模式主要是通過限制性內(nèi)切酶和核酸探針的特定組合進(jìn)行鑒定[7]。其中，使用IS6110探針進(jìn)行RFLP分析，已是結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體分型的“金標(biāo)準(zhǔn)”方法[8-9]。但RFLP對(duì)樣品純度要求較高，用量較大，RFLP的多態(tài)信息含量低且依賴于限制性內(nèi)切酶的種類與數(shù)量。與IS-RFLP原理類似的核糖體分型根據(jù)核糖體操縱子基因的保守序列設(shè)計(jì)探針，作為艱難梭菌分型的重要手段[10]。

1.3 隨機(jī)擴(kuò)增多態(tài)性DNA（random amplified polymorphic DNA, RAPD）

該技術(shù)通過設(shè)計(jì)一些非特異性小片段隨機(jī)引物，其中部分可與DNA序列結(jié)合并通過PCR擴(kuò)增，對(duì)產(chǎn)物進(jìn)行多態(tài)性分析，從而得出細(xì)菌的分型鑒定結(jié)果。在對(duì)28株泛耐藥肺炎克雷伯菌的分子分型中，RAPD-PCR揭示了18種相似度≥80%的不同分離株，且分型結(jié)果與耐藥模式顯著相關(guān)[11]。在銅綠假單胞菌的分型中，反應(yīng)條件標(biāo)準(zhǔn)化的RAPDPCR技術(shù)，比基于宏基因組的PFGE技術(shù)分辨率更高[12]。RAPD對(duì)艱難梭菌的分型分辨率也高于其他分子分型方法[13]。

1.4 重復(fù)序列PCR（repetitive element PCR, rep-PCR）

一些短重復(fù)序列廣泛分布于細(xì)菌基因組中，盡管功能未知，但可以作為細(xì)菌的指紋圖譜。通過擴(kuò)增這些短重復(fù)序列，可以揭示基因組間的差異。常見的重復(fù)序列家族有基因外重復(fù)回文序列（REP）、腸桿菌基因間重復(fù)一致序列（ERIC）和BOX片段。有研究發(fā)現(xiàn)rep-PCR的初步分型可作為變形鏈球菌多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing,MLST）的預(yù)篩選工具，這種預(yù)篩選可以為下一步應(yīng)用更高級(jí)的分子技術(shù)節(jié)約成本[14]。在對(duì)耐甲氧西林金黃色葡萄球菌（MRSA）的分型中，基于rep-PCR的DiversiLab分型的鑒別力高于spa分型，但低于PFGE分型[15]。

1.5 多位點(diǎn)可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)分析（multiple-locus variable-number tandem repeat analysis, MLVA）

可變數(shù)目串聯(lián)重復(fù)序列（variable number of tandem repeats, VNTR）是基因組中一類較短的序列重復(fù)、首尾相連的序列，MLVA通過PCR與電泳技術(shù)，分析多種VNTR基因座的數(shù)量進(jìn)行基因分型?；贛LVA的多重PCR技術(shù)在大腸埃希菌與志賀菌快速分型方面，優(yōu)于MLST和DiversiLab rep-PCR[16]。在鼠疫疫情監(jiān)測(cè)中，MLVA方案能夠獲得與基于SNP分析基本相同的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系，在基因分型中也具有較高的判別力[17]。在產(chǎn)超廣譜 β內(nèi)酰胺酶（ESBL）的大腸埃希菌的流行病學(xué)分型中，7通用位點(diǎn)大腸埃希菌MLVA（GECM-7）與PFGE分型結(jié)果的相關(guān)性很好[18]。盡管MLVA是一種快速、簡(jiǎn)便、廉價(jià)且可重現(xiàn)的高分辨率基因分型方法，該方法也依舊存在一些缺陷，如容易受位點(diǎn)本身以及酶切片段長(zhǎng)度的影響。另外，VNTR基因座在細(xì)菌基因組中并不總是常見的，這限制了MLVA的應(yīng)用[7]。

1.6 高分辨率熔解分析技術(shù)（high-resolution melting analysis, HRM）

HRM是實(shí)時(shí)PCR與熔解曲線分析相結(jié)合的一種技術(shù)。與特定熒光染料結(jié)合的雙鏈DNA在升溫過程中會(huì)解鏈為單鏈，從而使監(jiān)測(cè)的熒光信號(hào)發(fā)生變化。不同的DNA長(zhǎng)度，GC含量與堿基差異都會(huì)形成不同的熔解曲線。在對(duì)MRSA的基于PCR測(cè)序鑒定的12種spa分型中，HRM識(shí)別出了其中的11種[19]。有研究人員建立了多重HRM分析方法以區(qū)分結(jié)核分枝桿菌復(fù)合體的罕見亞型，其分型結(jié)果與商用試劑盒結(jié)果達(dá)到了100%一致性[20]。

1.7 PCR-RFLP

結(jié)合了PCR技術(shù)的RFLP分析彌補(bǔ)了單純RFLP的一些缺點(diǎn)。由于酶切完成后不進(jìn)行探針雜交，而是通過PCR擴(kuò)增后將特定片段進(jìn)行電泳分離分析，樣本DNA可直接來(lái)源于人體或環(huán)境并且操作步驟得以簡(jiǎn)化[7]?；趕pa和coa基因的PCR-RFLP技術(shù)對(duì)金黃色葡萄球菌的辨別指數(shù)達(dá)到了0.83，高于單基因座的結(jié)果[21]。在肺炎鏈球菌的分子血清分型中，RFLP方法比其他血清學(xué)方法具有更好的預(yù)期特異性[22]。

1.8 擴(kuò)增片段長(zhǎng)度多態(tài)性（amplified fragment length polymorphism, AFLP）

AFLP的原理是基因組DNA先用限制性內(nèi)切酶切割，然后將雙鏈接頭與DNA酶切片段的黏性末端相連，以接頭序列和相鄰酶切位點(diǎn)序列作為引物結(jié)合位點(diǎn)，加入互補(bǔ)引物之后進(jìn)行PCR擴(kuò)增與電泳分析。該方法具有多態(tài)性豐富，無(wú)需預(yù)知被測(cè)細(xì)菌的全基因組序列，不受環(huán)境影響，無(wú)復(fù)等位效應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)。在耐萬(wàn)古霉素腸球菌的院內(nèi)暴發(fā)感染調(diào)查中，AFLP方法的系統(tǒng)發(fā)育分析與全基因組測(cè)序（whole-genome sequencing, WGS）接近，在排除相關(guān)性方面更有優(yōu)勢(shì)[23]。該方法對(duì)接頭序列設(shè)計(jì)要求較高，因?yàn)樾枰紤]引物和限制性內(nèi)切酶序列的聯(lián)系[24]。

1.9 MLST

MLST通過檢測(cè)若干個(gè)管家基因的內(nèi)部片段序列的核苷酸變異，分析不同樣本的等位基因多樣性，并將每組不同等位基因的排列組合定義為一種序列型（sequence type, ST），通過ST來(lái)對(duì)細(xì)菌進(jìn)行分型，是當(dāng)下最流行的基因分型方法之一[25]。MLST的主要缺點(diǎn)是需要知曉待測(cè)微生物的基因組序列信息，以便決定能否使用MLST以及選擇管家位點(diǎn)。除此之外，親緣關(guān)系密切菌株的變異也難以通過MLST檢出。鑒于MLST的局限性，基于相似原理開發(fā)的其他方法如通過檢測(cè)VNTR的MLVA可以獲得與MLST相似的結(jié)果[26]。

1.10 成簇規(guī)則間隔的短回文重復(fù)序列（clustered regularly interspaced short palindromic repeats,CRISPR）

CRISPR位點(diǎn)包含多個(gè)直接重復(fù)(DR)序列，它們之間由可變間隔序列分隔。DR序列通常是保守的，而間隔序列則是多變的，且DR和間隔序列的數(shù)量不定，它們構(gòu)成了一組獨(dú)特的DNA序列，為分型提供了基礎(chǔ)。CRISPR可用于腸炎沙門菌不同亞型的鑒別，且與全基因組序列分型結(jié)果有著良好的一致性[27]。在幽門螺桿菌的分型中，CRISPR-毒力分型結(jié)果與高辨別指數(shù)的RAPD方法相同，且可重復(fù)性好[28]。該方法仍存在一些局限性，比如部分菌株的分型仍存在爭(zhēng)議[29]，在某些目標(biāo)菌種中不存在CRISPR系統(tǒng)，以及在某些情況下位點(diǎn)的低變異性，可能會(huì)影響高分辨率分型結(jié)果。

1.11 WGS

WGS是基因分型的最終方案，有著高度的可重復(fù)性和區(qū)分度。用WGS進(jìn)行菌株分型和克隆親緣關(guān)系測(cè)定，通常是基于SNP分析，與對(duì)照菌株的參考基因組進(jìn)行比較，或通過與預(yù)先定義的一組核心基因（核心基因組MLST）逐個(gè)基因比較進(jìn)行分型，即全基因組測(cè)序的單核苷酸多態(tài)性分型（whole genome-based single nucleotide polymorphisms,wgSNP）和核心基因組多位點(diǎn)序列分型（core genome multilocus sequence typing,cgMLST）[30]。目前基于wgSNP的服務(wù)PathoBacTyper已經(jīng)可以實(shí)現(xiàn)400多種致病細(xì)菌的識(shí)別與基因分型，包括具有相同PFGE模式菌株間的分型[31]。cgMLST不同于傳統(tǒng)MLST檢測(cè)7個(gè)管家位點(diǎn)，它通過檢測(cè)核心基因組位點(diǎn)的差異，比對(duì)成百上千個(gè)基因進(jìn)行分型，分辨率更高[32]。由于DNA相比于蛋白質(zhì)具有更穩(wěn)定的性質(zhì)，WGS的結(jié)果比常規(guī)分子生物學(xué)分型結(jié)果更具可重復(fù)性，且實(shí)驗(yàn)室間的結(jié)果比較也更易實(shí)現(xiàn)。目前WGS技術(shù)應(yīng)用的主要阻礙在于高昂的成本和較長(zhǎng)的分析時(shí)間。

2 質(zhì)譜與振動(dòng)光譜技術(shù)

2.1 MALDI-TOF MS

該方法原理是通過激光脈沖照射待測(cè)結(jié)晶混合物，使其離子化解吸并電離，隨后電場(chǎng)將離子加速，測(cè)量離子的飛行時(shí)間，根據(jù)質(zhì)荷比轉(zhuǎn)化為質(zhì)譜圖，進(jìn)而分型[33]。該技術(shù)已廣泛應(yīng)用于許多病原體的鑒定與分型中。MRSA的質(zhì)譜分型結(jié)果準(zhǔn)確度與PFGE和噬菌體開放閱讀框分型（POT）相當(dāng)[34]。鮑曼不動(dòng)桿菌的分型結(jié)果與MLST基本一致，系統(tǒng)發(fā)育結(jié)果與rep-PCR結(jié)果顯示良好的相關(guān)性[35]。不過質(zhì)譜法對(duì)于某些細(xì)菌的分型結(jié)果容易出現(xiàn)偏差[36-37]。優(yōu)化對(duì)特異性峰的識(shí)別能夠提高判斷準(zhǔn)確性，提升數(shù)據(jù)庫(kù)的質(zhì)量也能提高鑒定成功率[38]。MALDI-TOF技術(shù)與傳統(tǒng)方法最顯著的差異體現(xiàn)在時(shí)間成本和消耗物成本上。盡管儀器與維護(hù)成本很高，綜合其準(zhǔn)確性、時(shí)間與成本效益，仍值得推廣。

2.2 傅里葉變換紅外光譜（Fourier transform infrared spectroscopy, FTIR）

微生物不同的組織成分在紅外光照射下發(fā)生振動(dòng)，經(jīng)傅里葉變換技術(shù)處理后，根據(jù)其特定的紅外吸收峰可用于分型，其中峰值強(qiáng)度提供了生化分子含量的定量信息，而峰值位置則提供了與細(xì)菌類型有關(guān)的定性信息[39]。在肺炎克雷伯菌的分型中，以WGS作為參考，F(xiàn)TIR與MALDI-TOF MS相比，表現(xiàn)出了更高的分型能力[40]。陰溝腸桿菌的FTIR分型結(jié)果與基于SNP的聚類分析和ST分型結(jié)果有良好的一致性[41]。在院內(nèi)流行革蘭陰性病原體的分型中，以MLST與PFGE為參考，F(xiàn)TIR能準(zhǔn)確地將同一ST型的肺炎克雷伯菌、銅綠假單胞菌和陰溝腸桿菌的分離株聚類[42]。

FTIR主要基于細(xì)菌的表型特征進(jìn)行分析，由于細(xì)菌存在廣泛的種內(nèi)多樣性，對(duì)于待檢樣本需要強(qiáng)調(diào)標(biāo)準(zhǔn)化的預(yù)處理流程（包括菌株培養(yǎng)、樣本制備和光譜采集等）[43]。同時(shí)因?yàn)楸硇投嘧?，且每個(gè)波段缺乏相應(yīng)的具有特定鑒別意義的生物標(biāo)記，有研究?jī)A向于檢測(cè)相對(duì)穩(wěn)定的基因組FTIR光譜[44-45]，或是利用人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)訓(xùn)練模型以提高分辨率[46]。

2.3 表面增強(qiáng)拉曼光譜（surface enhanced Raman spectroscopy, SERS）

光在發(fā)生散射時(shí)，有一部分強(qiáng)度極弱的光會(huì)發(fā)生頻率的改變，即拉曼散射。拉曼光譜是基于拉曼散射效應(yīng)，檢測(cè)分子振動(dòng)能級(jí)來(lái)對(duì)分子結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析的方法。目前多采用SERS技術(shù)放大原有的光譜信號(hào)以便于分析[47]。SERS結(jié)合微流控技術(shù)對(duì)MRSA的分型結(jié)果與MLST的結(jié)果有著良好的一致性[48]。在對(duì)喹諾酮類非敏感大腸埃希菌分型方面，與MLST預(yù)分型結(jié)果相比，SERS 結(jié)合主成分分析（PCA）算法實(shí)現(xiàn)了高度相似光譜之間的區(qū)分[49]。

拉曼光譜是一種快速、靈敏且穩(wěn)定的細(xì)菌檢測(cè)技術(shù)。拉曼光譜法比紅外光譜法有一些優(yōu)勢(shì)，例如水的干擾較小且譜帶較窄等。然而，拉曼光譜也需要昂貴的設(shè)備，并且操作更為復(fù)雜。常規(guī)分型技術(shù)的比較見表1。

表1 細(xì)菌分型方法的評(píng)價(jià)

續(xù)表1

3 總結(jié)

盡管特定的分型方法可能具有較高的分辨能力和良好的可重復(fù)性，但方法的復(fù)雜性、結(jié)果的解釋以及構(gòu)思并使用該方法所涉及的成本有可能超出實(shí)驗(yàn)室的能力。因此，分型方法的選擇應(yīng)取決于技術(shù)水平、實(shí)驗(yàn)室資源以及研究的目的和范圍。

隨著測(cè)序技術(shù)的進(jìn)步與譜學(xué)方法的拓展，新技術(shù)的應(yīng)用使得與細(xì)菌有關(guān)的檢測(cè)更為準(zhǔn)確，這有助于流行病學(xué)的研究與臨床實(shí)驗(yàn)室的工作開展，促進(jìn)公共衛(wèi)生與健康事業(yè)的進(jìn)步。