出生后不同發(fā)育階段小鼠耳蝸Connexin30的表達△

劉文靜 王文 王旭東 楊軍

縫隙連接是一種連接細胞間的通道，由相鄰細胞膜上的兩個半通道組成,半通道又是由6個相同(同聚體半通道)或不同(異聚體半通道)縫隙連接蛋白(Connexin，Cx)構成。 Cx在聽覺功能中發(fā)揮十分重要的作用，研究證實，編碼Cx26和Cx30的GJB2以及GJB6基因突變是導致人類非綜合征型遺傳性聾最常見的原因[1]，但Cx26和Cx30致聾機制目前尚未完全明確。人類GJB2基因與GJB6 具有77%的序列同源性，但Cx26和Cx30兩種蛋白在耳蝸功能中各自具有獨特的功能和不可替代的作用[2]。有研究發(fā)現，內淋巴電位(EP)的大幅度下降是GJB6基因敲除導致先天性聾的重要原因之一[3]。GJB6基因敲除可能通過小鼠對耳蝸血管紋內皮細胞超微結構的影響造成內皮細胞屏障破壞，從而引起EP缺失，最終導致耳聾[4]。EP的生成主要源于耳蝸外側壁，對耳蝸放大器及耳蝸高敏感性起重要作用。EP在小鼠新生階段出現，2周左右達成年水平，這表明出生后早期Cx30的表達在EP發(fā)育過程中具有重要意義。Cx的正常表達是決定縫隙連接生理作用的主要因素之一，連接蛋白在早期發(fā)育過程中的研究有利于闡明因GJB2基因異常而導致先天性聾的部分機制[5]。然而，Cx30在耳蝸早期發(fā)育過程中的表達及定位的研究較少，故本研究擬通過檢測出生后不同階段小鼠耳蝸的Cx30表達分布及其變化，探討其在聽覺功能中可能發(fā)揮的作用，為Cx30致聾機制的研究提供參考。

1 材料與方法

1.1實驗動物及分組 選取10周齡健康BALB/c小鼠8對作為種鼠，外耳道清潔，耳廓反射均正常。每對種鼠提供1個年齡段的新生鼠,按照出生后的天數將小鼠分為出生后(postmatal day,P)1天(P1)、5天(P5)、7天(P7)、10天(P10)、14天(P14)、21天(P21)以及30天(P30)共7組，每組6只。

1.2實驗方法

1.2.1耳蝸標本制備 將小鼠用4%多聚甲醛及0.9%生理鹽水經心臟灌注，迅速斷頭，置入新鮮配制的4%多聚甲醛溶液，在解剖顯微鏡(Leica，德國)下取出耳蝸；開放圓窗及卵圓窗，蝸尖打孔，行蝸管內灌注，室溫后固定1 h。P7及P7以上天齡的小鼠耳蝸置于10%EDTA4 ℃酌情脫鈣，定時更換脫鈣液，15%蔗糖溶液4 ℃浸泡3 h，30%蔗糖溶液過夜沉底。OCT(optimal cutting temperature)包埋劑4 ℃包埋3 h，沿耳蝸蝸軸水平作冰凍切片(Leica恒冷冰凍切片機)，片厚7 μm。

1.2.2免疫熒光染色 新鮮耳蝸冰凍切片室溫晾干1 min，PBS漂洗，洗OCT膠；0.3%Triton X-100/10%驢血清溶液室溫通透封閉處理35 min，PBS漂洗，滴加兔抗小鼠Cx30多克隆抗體(1∶200，Life Technologies公司)以及耳蝸支持細胞標記蛋白羊抗小鼠Sox2單克隆抗體(1∶200，Santa Cruz Biochemicals公司)4 ℃孵育過夜，用PBS代替一抗作空白對照，PBS漂洗；加抗兔Alexa Fluor 546 (1∶200，碧云天公司)和IFKineTMGreen Donkey Anti-Goat IgG (1∶200，博士德公司)37 ℃孵育1 h，PBS漂洗。DAPI(1∶800，碧云天公司)染核5 min，抗熒光淬滅劑封片。激光共聚焦顯微鏡(Leica，德國)下觀察，激發(fā)波長分別為561 nm、488 nm以及405 nm，綠色及紅色熒光為陽性結果。采用Image-Pro Plus 6.0軟件計算Cx30在P1、P5、P7、P10、P14、P21和P30小鼠耳蝸血管紋，P5、P7、P10、P14、P21和P30螺旋緣以及P7、P10、P14、P21和P30 Deiters細胞3個區(qū)域免疫熒光陽性染色的平均光密度值(average optical densities，AOD)。

1.3統(tǒng)計學方法 采用IBM-SPSS24.0(IBM Company，Armonk，New York，USA)軟件包進行統(tǒng)計學分析，多組間均數比較采用單因素方差分析(one-way ANOVO)，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1不同天齡小鼠耳蝸Cx30的表達 各組小鼠耳蝸外側壁均可見Cx30表達分布，并隨鼠齡的增加而出現年齡相關性改變。在P1組小鼠耳蝸Cx30呈點狀，其主要表達于不同蝸回的大上皮嵴柱狀細胞和耳蝸外側型，大上皮嵴是出生后耳蝸早期發(fā)育階段特有的細胞群，其胞核可被Spx2標記；在P1組Cx30呈點狀染色分布于不同蝸回的大上皮嵴頂部和基底部；而在不同蝸回的耳蝸外側壁Cx30陽性表達有差異，在頂回耳蝸外側壁未見有Cx30的表達，在中回，耳蝸外側壁開始出現Cx30的表達，其表達定位在毗鄰血管紋基底細胞的部分螺旋韌帶Ⅰ型纖維細胞；在底回，Cx30陽性表達不僅出現在螺旋韌帶纖維細胞，而且也表達于血管紋基底細胞(圖1a～i)。在P5組，不同蝸回的耳蝸外側壁均有Cx30表達，其呈連續(xù)線狀集中分布在血管紋基底細胞；螺旋韌帶纖維細胞中Cx30的表達消失。另外，螺旋緣內齒細胞和纖維細胞開始出現Cx30的點狀染色，在聽覺上皮，Cx30在大上皮嵴的染色不均勻分布，部分區(qū)域呈點狀染色，部分區(qū)域呈顆粒聚集(圖2a～f)。在P7組，大上皮嵴、螺旋緣及血管紋基底細胞均可見Cx30的表達，且其開始出現在Corti器支持細胞；Cx30點狀染色分布在3排Deiters細胞膜的側面(圖3a～f)。在P10組的聽覺上皮，Cx30在Corti器Deiters細胞的陽性表達清晰顯著，尤其是在基底側；除了殘留大上皮嵴細胞和螺旋緣外，內凹細胞開始有Cx30的表達；Cx30仍表達在血管紋基底細胞，呈鋸齒狀分布(圖3g～i)。在P14組，伴隨小鼠聽覺的形成，大上皮嵴退化解體，Cx30在內凹細胞呈現連續(xù)條帶狀染色；Corti器中Deiters細胞、Hensen細胞以及環(huán)繞內毛細胞的內指細胞均有Cx30的表達；耳蝸外側壁Cx30分布范圍自血管紋基底細胞向外延伸至螺旋韌帶，螺旋韌帶纖維細胞幾乎全部表達Cx30；Cx30在螺旋緣中的表達無明顯變化(圖4a～f)。在P21和P30組，Cx30在Corti器支持細胞、血管紋基底細胞、螺旋韌帶和螺旋緣中持續(xù)性表達(圖5a～i)。

圖1 P1小鼠耳蝸Cx30的表達分布 a.Cx30(紅色熒光)在P1耳蝸不同蝸回均有表達; b.在P1頂回,Cx30分布在大上皮嵴和外溝細胞; c.P1螺旋緣未見Cx30的表達; d、e.Cx30(紅色熒光)和Sox2(綠色熒光)在P1中回的表達,Cx30表達在血管紋后方螺旋韌帶纖維細胞、大上皮嵴和外凹細胞。Sox2標記大上皮嵴柱狀細胞; f.圖1d和圖1e的疊加成像; g.Cx30表達在P1底回血管紋基底細胞、少量螺旋韌帶纖維細胞和外凹細胞; h.Cx30表達在P1底回大上皮嵴; i.為圖1g和圖1h的疊加。ger:大上皮嵴(greater epithelial ridge),OS:外溝細胞(outer sulcus),sb:螺旋緣(spiral limbus),SV:血管紋(stria vascularis),SL:螺旋韌帶(spiral ligament)。 圖2 P5小鼠耳蝸Cx30的表達分布 a.Cx30表達分布在P5不同蝸回的耳蝸外側壁、螺旋緣及大上皮嵴; b.P5螺旋緣內齒細胞及纖維細胞可見Cx30的表達; c.P5血管紋基底細胞可見Cx30的表達; d、e.P5聽覺上皮Cx30(紅色熒光)和Sox2(綠色熒光)的表達分布。Cx30表達分布在P5大上皮嵴,Sox2標記大上皮嵴柱狀細胞; f.為圖2g和圖2h的疊加。ger:大上皮嵴(greater epithelial ridge),sb:螺旋緣(spiral limbus),Sf:血管紋(stria vascularis),SL:螺旋韌帶(spiral ligament)。

圖3 P7和P10小鼠耳蝸Cx30的表達分布 a～c.P7血管紋基底細胞和螺旋緣可見Cx30的表達; d、e.P7聽覺上皮Cx30(紅色熒光)和Sox2(綠色熒光)的表達分布,Deiters細胞(箭頭)可見Cx30的表達; f.為圖3d和圖3e的疊加; g～i. P10血管紋基底細胞、螺旋緣、大上皮嵴、Deiters細胞、內凹細胞和外溝細胞可見Cx30的表達。ger:大上皮嵴(greater epithelial ridge),sb:螺旋緣(spiral limbus),dc:Dei-ters細胞(Deiters cells), OS:外溝細胞(outer sulcus),is:內凹細胞(inner sulcus),SV:血管紋(stria vascularis),SL:螺旋韌帶(spiral liga-ment)。 圖4 P14小鼠耳蝸Cx30的表達分布 a～c.血管紋基底細胞以及螺旋韌帶纖維細胞可見Cx30的表達; d.螺旋緣及內凹細胞可見Cx30的表達; e. Cx30表達分布在Corti器Deiters細胞、Hensen細胞、內指細胞; f.P14聽覺上皮Cx30(紅色熒光)和Sox2(綠色熒光)圖像疊加。sb:螺旋緣(spiral limbus),dc:Deiters細胞(Deiters cells),hc: Hensen細胞(Hensen cells),is:內溝細胞(inner sulcus),SV:血管紋(stria vascularis),SL:螺旋韌帶(spiral ligament),sb:螺旋緣(spiral limbus),iph:內指細胞(inner phalangeal cells)。

圖5 P21及P30小鼠耳蝸Cx30的表達分布 a～c.P21組螺旋韌帶纖維細胞以及血管紋基底細胞可見Cx30的表達;d.P21組螺旋緣及內凹細胞有Cx30的表達;e. P21聽覺上皮Cx30的表達分布。Cx30表達分布在Corti器內指細胞、Deiters細胞和Hensen細胞;f.在明場下觀察Cx30在P21聽覺上皮Cx30的表達分布;g、h.在P30,螺旋韌帶纖維細胞、血管紋基底細胞及螺旋緣可見Cx30的表達;i.Corti器中Cx30(紅色熒光)和Sox2(綠色熒光)圖像疊加,Cx30表達分布在Corti器中內指細胞和Deiters細胞。sb:螺旋緣(spiral limbus),dc:Dei-ters細胞(Deiters cells),hc:Hensen細胞(Hensen cells),is:內溝細胞(inner sulcus),SV:血管紋(stria vascularis),SL:螺旋韌帶(spiral liga-ment),sb:螺旋緣(spiral limbus),iph:內指細胞(inner phalangeal cells)。

2.2免疫熒光半定量分析 不同發(fā)育階段小鼠耳蝸螺旋緣、Deiters細胞和血管紋Cx30的平均光密度值比較見表1,可見，與P5組相比較，P7、P10、P14、P21和P30組耳蝸螺旋緣Cx30平均光密度值增高(P<0.05)；與P7組相比，P10、P14、 P21和P30 Deiters細胞Cx30平均光密度值明顯增加(P<0.05)；與P1組比較，P5、P7、P10、P14、 P21和P30血管紋中Cx30平均光密度值均增高(P<0.05)。

表1 不同天齡小鼠耳蝸不同部位Cx30的平均光密度值(n=6只)

3 討論

縫隙連接通道可通過介導離子、第二信使和小分子代謝物等發(fā)育所需的營養(yǎng)物質在細胞間的傳遞，執(zhí)行細胞間通訊，從而實現其在組織發(fā)育過程中的作用。有研究報道Cx30條件敲除小鼠Corti器內毛細胞發(fā)育受阻及外毛細胞帶狀突觸數量的減少，影響神經遞質的釋放，進而引起感覺毛細胞聲音信號傳遞的異常[6,7]。本研究結果顯示，出生后各個發(fā)育階段小鼠耳蝸均可見Cx30的表達，出生后早期階段，小鼠耳蝸Cx30特異性表達在大上皮嵴及外溝細胞；在聽覺形成時，大上皮嵴退化及凋亡，最終被內凹細胞替代，Cx30的表達亦消失。Jagger等[8]通過全細胞膜片鉗聯合熒光染料示蹤技術，發(fā)現大上皮嵴細胞間染料的擴散，縫隙連接和半通道阻斷劑可將大上皮嵴細胞間染料耦聯受阻，從而確定了其細胞間存在功能性的縫隙連接耦合。另有研究報道，在聽覺形成前，Cx組成的半通道可介導大上皮嵴自發(fā)性釋放三磷酸腺苷(ATP)，促使未成熟的內毛細胞去極化，從而引起初級聽覺神經元動作電位的發(fā)放[9]。本研究結果顯示，P1～P5小鼠耳蝸Corti器Deiters細胞Cx30無明顯表達，提示在此發(fā)育階段耦聯大上皮嵴細胞和外溝上皮細胞的縫隙連接通道尚未形成，進一步說明大上皮嵴ATP的釋放可能不依賴于縫隙連接，而通過半通道單獨發(fā)揮作用。已有研究報道，大上皮嵴發(fā)育異?？赡軐е孪忍煨远@[10]，因此，可以認為Cx30在大上皮嵴的早期表達在維持其正常生理活動中起重要作用。

文中結果顯示在Corti器支持細胞，Cx30的表達亦呈現年齡依賴性，到P7時Deiters細胞開始有Cx30的表達，并隨著年齡的增長其表達出現變化。熒光染料示蹤技術也證實了聽覺形成前不同鼠齡Corti器支持細胞間染料耦聯存在差異[11]，據報道，出生后早期Deiters細胞中縫隙連接蛋白的表達在鈣波形成中起十分重要的作用；在耳蝸支持細胞和外溝細胞，Cx26和Cx30組成的同型縫隙連接或異型縫隙連接是鈣波產生及傳播的解剖生理基礎[12]，Cx26或Cx30表達的缺陷可抑制耳蝸細胞鈣波的產生和傳播。超微結構研究顯示，Cx30缺失小鼠Corti器支持細胞縫隙連接斑面積和數量明顯減少，同時，缺失Cx30亦可影響D-葡萄糖同系物在支持細胞間擴散的速度和范圍，并認為Cx30突變引起耳聾的原因可能是耳蝸內葡萄糖重要代謝物質的轉運障礙；此外，Cx30介導的細胞間通訊在促進感覺毛細胞損傷修復過程中也有著相當重要的作用，Cx30突變可致支持細胞遷移修復能力下降[13]。

本研究中，Cx30在小鼠耳蝸側壁的表達也具有年齡依賴性。新出生階段，Cx30表達分布在血管紋基底細胞及其和臨近的少量螺旋韌帶纖維細胞，該階段這些細胞已被實驗證實存在區(qū)域性染料擴散，另外，這一發(fā)育階段血管紋基底細胞可由出生后的螺旋韌帶纖維細胞通過間質上皮轉化生成[14]。由此可以推測，Cx30及其形成的縫隙連接通道可能參與血管紋的發(fā)育過程。在P14，Cx30表達的擴展與EP成熟的時程相平行，提示Cx30在耳蝸側壁的早期表達及其發(fā)育中的表達變化對EP的產生和維持具有十分重要的意義。此外，本研究還發(fā)現Cx30在生后早期小鼠螺旋緣的表達變化，即：P1時螺旋緣Cx30無表達，到P5時Cx30開始表達，且持續(xù)至成年。已有研究提出，Cx30或Cx26組成的縫隙連接通道可介導成年鼠螺旋緣纖維細胞之間葡萄糖的轉運[15]，對維持耳蝸離子穩(wěn)態(tài)具有十分重要的作用。本實驗結果進一步指出，螺旋緣細胞間Cx30以及由Cx30介導的縫隙連接細胞間通訊在出生后早期建立，以保證聽覺功能發(fā)育的需要。

本研究用免疫熒光染色方法檢測了Cx30在出生后不同天齡小鼠耳蝸中的表達及分布，發(fā)現了其在出生后耳蝸早期發(fā)育過程中表達的時空差異性，小鼠聽覺形成后，Cx30的表達趨于穩(wěn)定，據此推斷Cx30年齡相關性表達可能在聽覺功能的建立和成熟過程中具有十分重要的作用；這尚需通過后續(xù)實驗進一步研究證實。