藤茶提取物的降尿酸作用研究

吳淑慧，於洪建，於 天，鄭志剛，柯 達(dá)，趙 玲,

（1.武漢輕工大學(xué)生物與制藥工程學(xué)院，湖北武漢 430023；2.無錫市世紀(jì)生物工程有限公司，江蘇無錫 214000；3.天津益倍元天然產(chǎn)物技術(shù)有限公司，天津 300000）

高尿酸血癥（Hyperuricemia，HUA）是體內(nèi)尿酸生成增加或尿酸排泄減少而導(dǎo)致尿酸水平高于正常值的一種代謝性疾病[1]。高尿酸血癥不僅是引發(fā)痛風(fēng)[2]的關(guān)鍵生化指標(biāo)，還與糖尿病[3]、高血壓[4]、慢性腎病[5]、冠心病[6]等疾病密切相關(guān)。尿酸是黃嘌呤和次黃嘌呤在黃嘌呤氧化酶（XOD）的參與下代謝的最終產(chǎn)物，而在尿酸的排泄過程中，超過70%的尿酸會通過腎臟排泄[7]，黃嘌呤氧化酶異常上調(diào)導(dǎo)致嘌呤代謝受阻和尿酸生成增多[8]。目前臨床西藥治療高尿酸血癥藥物主要有抑制尿酸生成藥、促進(jìn)尿酸排泄藥和促進(jìn)尿酸溶解藥三類[9]，其中一線治療藥物別嘌呤醇為黃嘌呤氧化酶抑制劑，通過抑制尿酸生成而達(dá)到降尿酸的目的，但臨床上只有不到一半患者可以控制其尿酸水平，且別嘌呤醇的不良反應(yīng)與HLAB*5801等位基因陽性率有相關(guān)性，有國際組織報道華人對HLA-B*5801的攜帶率較高[10]，因而限制了別嘌呤醇的使用；促進(jìn)尿酸排泄藥物苯溴馬隆是通過抑制腎小管對尿酸的重吸收，從而降低血中尿酸濃度，臨床用藥發(fā)現(xiàn)苯溴馬隆長期服用會造成肝腎損傷[11]，因而尋找到一種副作用小且可安全使用的天然藥物具有重大意義。

藤茶為顯齒蛇葡萄（Ampelopsis grossedentata（Hand-Mazz）W.T.Wang）的嫩莖葉，始載于《茶經(jīng)》，是葡萄科蛇葡萄屬多年生木質(zhì)藤本植物[12]，主要分布于我國湖南、湖北、云南、貴州、廣東、廣西、福建等長江以南各省[13]。藤茶即可入藥也可食用，民間用其嫩莖葉入茶已有數(shù)百年的歷史。據(jù)《中草藥匯編》等文獻(xiàn)記載，藤茶入藥有清熱解毒的功效，可治療感冒風(fēng)熱、咽喉腫痛等[14]?，F(xiàn)代研究表明，藤茶及其提取物具有抗炎[15]、抗菌[16]、抗氧化[17]、降血糖[18]、降血脂[19]、降壓[20]等多種藥理活性。本實驗使用藤茶提取物灌胃氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠模型，對藤茶提取物降尿酸作用進(jìn)行研究，評價藤茶提取物的降尿酸水平及對肝臟和腎臟組織的影響，為開發(fā)藤茶降尿酸作用提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

SPF級雄性ICR小鼠 體質(zhì)量（18~22 g），斯貝福（北京）生物技術(shù)有限公司，實驗動物許可證號：SCXK（京）2019-0010；藤茶提取物（50%的二氫楊梅素和5%的槲皮素） 無錫市世紀(jì)生物工程有限公司；別嘌呤醇（批號：20180305） 世貿(mào)天階制藥（江蘇）有限責(zé)任公司；氧嗪酸鉀（批號：O0164） 武漢遠(yuǎn)成共創(chuàng)科技有限公司；羧甲基纖維素鈉（CMC-Na）國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）、黃嘌呤氧化酶（XOD）試劑盒 南京建成生物工程研究所。

Enspire酶標(biāo)儀 美國PerkinElmer；FC5515R高速冷凍離心機(jī) 美國OHAUS；EL-104 分析天平

瑞士梅特勒-托利多；HH-2電熱恒溫水浴鍋 上海皓莊儀器；Eclipse Ci熒光顯微鏡 日本尼康公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 高尿酸血癥小鼠模型建立 12只ICR雄性小鼠適應(yīng)性喂養(yǎng)7 d后，隨機(jī)分為正常組（NC）和模型組（MC），每組6只。第8 d上午，模型組腹腔注射給藥氧嗪酸鉀（用0.5%羧甲基纖維素鈉配制成12 mg/mL乳懸液）進(jìn)行造模，注射體積為10 g/0.1 mL，連續(xù)7 d以制備高尿酸血癥模型。造模7 d后，給藥1 h后，對小鼠進(jìn)行眼內(nèi)眥靜脈采血，4 ℃下靜置1 h，3500 r/min離心15 min分離血清，待用。

1.2.2 給藥方法 以建立的HUA小鼠模型為基礎(chǔ)，將48只ICR雄性小鼠隨機(jī)分為正常對照組（NC）、模型對照組（MC）、別嘌呤醇組（ALLO）、藤茶提取物低（L）、中（M）、高（H）劑量組，共6組，每組8只。確定別嘌呤醇給藥劑量為10 mg/kg/d，藤茶提取物低、中、高劑量組對應(yīng)濃度分別為100、200、400 mg/kg/d。第8~14 d期間，正常組注射生理鹽水，其余組注射等體積（300 mg/kg）氧嗪酸鉀造模。第15~28 d期間，在正常組與其余各組分別注射生理鹽水和氧嗪酸鉀1 h后，別嘌呤醇組和藤茶提取物給藥組分別灌胃相應(yīng)劑量別嘌呤醇和藤茶提取物，其中正常組和模型組灌胃等體積（10 g/0.1 mL）生理鹽水。

1.2.3 小鼠體重相對變化率 每天觀察小鼠的一般情況并在給藥前對小鼠進(jìn)行稱重，計算每只小鼠的體重相對變化率（%）=（每日稱量體重/實驗開始前體重）×100

1.2.4 小鼠肝腎系數(shù) 小鼠頸脫臼處死后取其肝臟和腎臟進(jìn)行稱量，計算各組小鼠的肝腎系數(shù)，肝腎系數(shù)（mg/g）=小鼠臟器（mg）/小鼠體重（g）。

1.2.5 相關(guān)指標(biāo)檢測 末次給藥1 h后，對小鼠進(jìn)行摘眼球取血，取血0.5 mL，低溫靜置1 h后，3500 r/min離心15 min分離血清；取腎臟和肝臟，4%多聚甲醛溶液固定，石蠟包埋，HE染色，病理組織學(xué)檢測；準(zhǔn)確稱取肝臟，按試劑盒說明書制備肝臟勻漿。按照試劑盒檢測說明書操作測定各組小鼠血清中尿酸（UA）、尿素氮（BUN）、肌酐（CRE）、天門冬氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（AST）、谷氨酸氨基轉(zhuǎn)氨酶（ALT）和肝臟黃嘌呤氧化酶（XOD）含量。

1.3 數(shù)據(jù)分析

采用 SPSS 23.0 統(tǒng)計軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)處理，實驗數(shù)據(jù)以平均值±標(biāo)準(zhǔn)差（x ˉ±s）表示，組間比較用單因素方差分析，考察各組間的統(tǒng)計學(xué)差異；P<0.05表示有統(tǒng)計學(xué)差異，P<0.01表示有顯著統(tǒng)計學(xué)差異。

2 結(jié)果與分析

2.1 小鼠體質(zhì)量相對變化率情況

圖1 顯示，各組小鼠在實驗期間，體重相對變化率情況總體呈增長趨勢，但與正常組相比，各組間均無統(tǒng)計學(xué)差異（P>0.05），說明別嘌呤醇和藤茶提取物對小鼠生長無明顯影響。

圖 1 小鼠體重相對變化率情況Fig.1 Relative change rate of mice body weight

2.2 小鼠肝腎系數(shù)

藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠臟器系數(shù)的影響見表1。與正常組比較，模型組小鼠的肝臟、腎臟系數(shù)均有所上升，肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)具有顯著水平（P<0.05）。與模型組相比，別嘌呤醇組肝臟系數(shù)和腎臟系數(shù)顯著降低（P<0.05），藤茶提取物組肝臟、腎臟系數(shù)均有所降低，其中200和400 mg/kg藤茶提取物組腎臟指數(shù)有顯著性差異（P<0.05）。說明藤茶提取物有降低高尿酸血癥小鼠肝臟、腎臟指數(shù)的作用。

表 1 藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠臟器系數(shù)的影響Table 1 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on organ coefficient of HUA mice

2.3 對高尿酸血癥小鼠血清尿酸（UA）的影響

與正常組相比，模型組組血清尿酸值極顯著增加40.3%（P<0.01）；與模型組相比，灌胃200和400 mg/kg藤茶提取物后，小鼠血清尿酸值分別降低22.65%（P<0.05）和29.15%（P<0.01），別嘌呤醇組血清尿酸水平顯著降低69.15%（P<0.01），灌胃100 mg/kg藤茶提取物有降低小鼠血清尿酸值但無統(tǒng)計學(xué)差異，可能是因為100 mg/kg藤茶提取物的血藥濃度達(dá)不到降低血尿酸的作用，見圖2。綜上，灌胃不同劑量藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠的降尿酸作用明顯差異，200和400 mg/kg藤茶提取物有良好降尿酸效果。

圖 2 藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠血清尿酸值的影響Fig.2 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on serum uric acid value in HUA mice

圖 3 藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠血清肌酐和尿素氮含量的影響Fig.3 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on serum CRE and BUN in HUA mice

2.4 對高尿酸血癥小鼠血清肌酐（CRE）和尿素氮（BUN）的影響

血清肌酐和尿素氮均通過腎臟進(jìn)行代謝，臨床上常用來評估腎臟損傷程度[21]。藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠血清肌酐和尿素氮含量的影響見圖3。與正常組相比，模型組肌酐和尿素氮水平顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，灌胃100和200 mg/kg藤茶提取物降低肌酐水平（P<0.05），200 mg/kg藤茶提取物顯著降低尿素氮水平（P<0.01），400 mg/kg藤茶提取物顯著降低肌酐和尿素氮水平（P<0.01）；與模型組相比，別嘌呤醇組顯著降低尿素氮水平（P<0.01），肌酐水平有降低，但無顯著差別。

圖 4 藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠血清AST和AST含量的影響Fig.4 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on serum AST and ALT in HUA mice

2.5 對高尿酸血癥小鼠血清谷草轉(zhuǎn)氨酶（AST）和谷丙轉(zhuǎn)氨酶（ALT）含量的影響

AST和ALT為臨床上診斷肝臟受損程度指標(biāo)，肝細(xì)胞膜通透性增加或肝細(xì)胞壞死均可導(dǎo)致ALT和AST水平升高[22]。藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠血清 AST 和 AST含量的影響見圖4。與正常組相比，模型組小鼠血清AST、ALT含量極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，灌胃100和200 mg/kg藤茶提取物可顯著降低AST含量（P<0.05），400 mg/kg藤茶提取物可極顯著降低AST含量（P<0.01）；灌胃100 mg/kg藤茶提取物可顯著降低ALT含量（P<0.05），200和400 mg/kg藤茶提取物可極顯著降低ALT含量（P<0.01）；別嘌呤醇組可降低AST、ALT含量（P<0.05）。說明藤茶提取物可降低AST、ALT含量，且具有劑量依賴性。

2.6 對小鼠肝臟組織XOD活性的影響

圖5 表明，與正常組相比，模型組小鼠肝臟組織中XOD活性極顯著升高（P<0.01）；與模型組相比，別嘌呤醇給藥組小鼠肝臟XOD活性極顯著降低（P<0.01）；灌胃200 mg/kg藤茶提取物可顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性（P<0.05），灌胃400 mg/kg藤茶提取物可極顯著降低高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性（P<0.01）。說明藤茶提取物可以降低高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性。

圖 5 藤茶提取物對高尿酸血癥小鼠肝臟組織XOD活性的影響Fig.5 Effects of Ampelopsis grossedentata extract on XOD activities in HUA mice

2.7 小鼠腎組織病理變化

如圖6可見，正常組小鼠腎小管細(xì)胞整體排列緊密，形態(tài)正常且飽滿，腎小球結(jié)構(gòu)清楚；模型組小鼠腎小球數(shù)量未見明顯差異，腎小管上皮細(xì)胞空泡變形，輕度炎癥浸潤；與模型組相比，別嘌呤醇組小鼠腎小管官腔擴(kuò)張明顯，腎小球萎縮變形，炎癥細(xì)胞浸潤；藤茶提取物各劑量組小鼠腎小管形態(tài)與模型組相比輕微改善。

2.8 小鼠肝組織病理變化

由圖7所示，各組肝細(xì)胞形態(tài)正常，與空白組相比，模型組小鼠肝細(xì)胞伴隨輕度水腫；與模型組相比，別嘌呤醇組小鼠肝細(xì)胞伴隨輕度水腫和輕微炎癥細(xì)胞浸潤；藤茶提取物各劑量組小鼠肝細(xì)胞無壞死且正常。

圖 6 AGE對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠腎臟的影響（200×）Fig.6 Effects of AGE on the influence of kidney in hyperuricemia mice induced by potassium oxonate（200×）

圖 7 AGE對氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠肝臟的影響（200×）Fig.7 Effects of AGE on the influence of liver in hyperuricemia mice induced by potassium oxonate (200×)

3 討論與結(jié)論

近年來，由于生活方式和飲食結(jié)構(gòu)的改變，高尿酸血癥已成為威脅現(xiàn)代人健康的常見疾病[23]。有研究表明高尿酸血癥患者的患病率逐年升高，而長期的血尿酸水平過高，不僅引起痛風(fēng)、腎臟病變和代謝性疾病，患者的AST、ALT等指標(biāo)水平也高于正常人，其原因可能是尿酸水平通過引起胰島素抵抗而致代謝性疾病[24]。黃嘌呤氧化酶廣泛存在于哺乳動物肝臟中，是嘌呤代謝過程中的關(guān)鍵酶，在尿酸調(diào)控過程中發(fā)揮重要作用，尿酸是由黃嘌呤氧化酶氧化次黃嘌呤所產(chǎn)生的，再經(jīng)由腎小管排出體外[25?28]。氧嗪酸鉀為一種尿酸酶抑制劑，可特異性阻止尿酸降解，從而升高血清尿酸水平[29]。本實驗選用氧嗪酸鉀誘導(dǎo)高尿酸血癥小鼠模型[30]，模型組血尿酸值與正常組相比升高40.3%，表明造模成功。

實驗結(jié)果顯示，與模型相比，藤茶提取物各劑量組對高尿酸血癥小鼠的血尿酸含量有明顯的降低作用，且不同濃度藤茶提取物的降尿酸效果表現(xiàn)為：400>200>100 mg/kg藤茶提取物。血清肌酐和尿素氮用來反映腎功能情況，谷丙轉(zhuǎn)氨酶和谷草轉(zhuǎn)氨酶則可反映肝功能情況，與正常組相比，模型組血清CRE、BUN、AST、ALT和肝臟XOD含量極顯著升高（P<0.01），肝腎系數(shù)上升，說明持續(xù)的高尿酸水平可能對腎功能和肝功能產(chǎn)生損傷；與模型組相比，藤茶提取物能明顯降低血清CRE、BUN、AST、ALT和肝臟XOD水平，同時肝腎系數(shù)下降，表明藤茶提取物對肝臟和腎臟有保護(hù)作用。藤茶提取物給藥組能夠降低血清尿酸水平可能是通過降低XOD含量，從而減少尿酸生成或促進(jìn)尿酸排泄，進(jìn)而達(dá)到降尿酸的效果。病理組織學(xué)形態(tài)檢查發(fā)現(xiàn)，別嘌呤醇組的腎組織細(xì)胞有明顯空泡變化，肝臟細(xì)胞有輕微水腫和炎癥浸潤，而藤茶提取物給藥組對肝腎組織損傷明顯小于別嘌呤醇，說明藤茶提取物給藥組能夠有效改善因高尿酸血癥而導(dǎo)致的肝腎功能損傷。

綜上，藤茶提取物能夠明顯降低氧嗪酸鉀誘導(dǎo)的高尿酸血癥小鼠血尿酸水平，且作用與劑量有正相關(guān)趨勢。其機(jī)制可能是通過降低小鼠肝臟XOD活性，從而降低血清尿酸水平，同時對肝腎組織有明顯保護(hù)作用，但其具體作用機(jī)制還需要進(jìn)一步研究探索，為開發(fā)藤茶降尿酸作用提供實驗依據(jù)。