骨架蛋白對(duì)肉持水性的影響及機(jī)制研究進(jìn)展

孫良格，張新笑，卞 歡，鄒 燁,，徐為民,，王道營(yíng),, ，李鵬鵬,,

（1.江蘇大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，江蘇鎮(zhèn)江 212013；

2.江蘇省農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工所，江蘇南京 210014）

骨架蛋白是肌肉細(xì)胞的重要結(jié)構(gòu)成分，是肌纖維網(wǎng)絡(luò)結(jié)構(gòu)中維持空間構(gòu)型、承受外力以及保持內(nèi)部結(jié)構(gòu)有序性的一類(lèi)蛋白質(zhì)。骨架蛋白對(duì)肉類(lèi)品質(zhì)的影響一直是許多學(xué)者研究觀察和分析的主題，骨架蛋白的降解影響宰后肉品的質(zhì)量，包括嫩度、持水性等方面[1]。肉的持水性（Water-holding capacity，WHC），是指肌肉保持原有水分的能力。持水性不僅影響肉的嫩度、風(fēng)味等感官品質(zhì)，還直接影響肉類(lèi)屠宰加工企業(yè)的經(jīng)濟(jì)效益[2]。

汁液流失（Drip loss）經(jīng)常被用來(lái)衡量肉的持水性。從1860年開(kāi)始，肉品科學(xué)家開(kāi)始研究肌肉汁液流失的機(jī)理，致力于研究影響肌肉持水能力的因素[2]。1995年Huff-Lonergan等[3]人提出汁液流失可能與蛋白質(zhì)降解有關(guān)，骨架蛋白包括膜結(jié)合蛋白踝蛋白（Talin）、肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（Dystrophin）等聯(lián)結(jié)肌原纖維和細(xì)胞外基質(zhì)蛋白，對(duì)維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)和細(xì)胞與細(xì)胞間的粘附起關(guān)鍵作用，因此，骨架蛋白的降解影響宰后肉品的汁液流失[4]。例如，細(xì)胞膜骨架蛋白跨膜蛋白整合素（Integrin）的降解有助于汁液流失通道的形成，增加汁液流失[5]；黏著斑蛋白（Vinculin）的緩慢降解和Talin的快速降解影響豬肉宰后成熟過(guò)程中肉的汁液流失的增加[6]。錢(qián)書(shū)意等[7]研究表明宰后凍結(jié)肉的骨架蛋白結(jié)構(gòu)出現(xiàn)改變，會(huì)使骨架蛋白之間聚集，蛋白質(zhì)溶解度降低。蛋白的疏水作用增強(qiáng)和水合力下降導(dǎo)致肉品持水性降低。

宰后肉品的汁液損失在0.1%~10%之間，在分割和貯藏過(guò)程的損失率可達(dá)2%~10%，給肉類(lèi)屠宰加工行業(yè)造成數(shù)億元經(jīng)濟(jì)損失[8]。如何降低汁液損失率仍然是肉類(lèi)研究學(xué)者們共同努力的目標(biāo)。開(kāi)展宰后肉品持水性與骨架蛋白關(guān)系研究，不僅能夠提高肉品質(zhì)量、減少經(jīng)濟(jì)損失，而且有助于揭示宰后肉品汁液流失形成機(jī)理。Puolanne等[9]認(rèn)為肉的持水機(jī)理仍需進(jìn)一步研究，其中骨架蛋白對(duì)持水性的影響需要結(jié)合pH、離子的種類(lèi)和強(qiáng)度及蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)性質(zhì)等進(jìn)一步研究闡明。本文將對(duì)近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的骨架蛋白的結(jié)構(gòu)功能、骨架蛋白對(duì)持水性的影響及影響骨架蛋白降解的因素進(jìn)行綜述。

1 骨架蛋白概述

細(xì)胞骨架在狹義上包括微絲、微管和中間纖維，它們由多種蛋白質(zhì)以不同方式組裝而成。微絲是由肌動(dòng)蛋白構(gòu)成；微管是由α和β管蛋白和少量微管結(jié)合蛋白的聚合作用而形成的管狀纖維；中間纖維是由α-螺旋桿狀、長(zhǎng)狀蛋白裝配而成。骨骼肌細(xì)胞骨架可被分為3種：肌小節(jié)內(nèi)骨架、肌小節(jié)外骨架和肌細(xì)胞膜骨架。伴肌動(dòng)蛋白（Nebulin）排在肌原纖維上的肌節(jié)內(nèi)，這種蛋白是肌小節(jié)內(nèi)的主要骨架蛋白；肌小節(jié)外骨架蛋白主要包含肌間線蛋白（Desmin）、巢蛋白（Nestin）、聯(lián)絲蛋白（Synemin）和核纖層蛋白（Lamins），它們位于肌原纖維周?chē)?，連接Z盤(pán)、核膜和肌細(xì)胞膜之間；肌細(xì)胞膜骨架蛋白包括Vincullin、血影蛋白（Sepectrin）、Dystrophin、Integrins等跨膜的和與膜相連的蛋白[5]。表1總結(jié)了肌肉中的主要骨架蛋白的分子量、所處肌肉位置以及與之結(jié)合的相關(guān)蛋白。骨架蛋白的功能主要包括以下幾點(diǎn)：①負(fù)責(zé)信息交流，骨架蛋白能夠在肌原纖維與胞外基質(zhì)兩者之間建立聯(lián)系，使細(xì)胞形成一個(gè)系統(tǒng)復(fù)雜的信息交流中心[10]；②調(diào)節(jié)和穩(wěn)定肌肉收縮，骨架蛋白具有維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)并對(duì)肌肉收縮起到調(diào)節(jié)和穩(wěn)定的作用[11]；③連接肌節(jié)，細(xì)絲狀的骨架蛋白與細(xì)絲、粗絲平行排列，位于肌原纖維的空隙，起到連接肌節(jié)的作用[11]；④調(diào)節(jié)細(xì)肌絲的長(zhǎng)度，部分骨架蛋白可以作為一個(gè)分子尺調(diào)節(jié)細(xì)肌絲的長(zhǎng)度以及細(xì)肌絲的排列，比如Desmin[12]。

2 骨架蛋白與肉持水性的關(guān)系

2.1 肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白（Dystrophin）對(duì)肉持水性的影響

Dystrophin是一種胞內(nèi)桿狀蛋白，定位于肌膜的內(nèi)表面，由3685個(gè)氨基酸組成的分子量為427 kDa的細(xì)胞骨架蛋白，占肌肉骨架蛋白比例超過(guò)5%以上[13]。Dystrophin具有四大功能域，分別包括N端區(qū)、棒狀區(qū)、半胱氨酸富集區(qū)、C端區(qū)。它的N終端和部分中間桿域與細(xì)胞骨架絲狀肌動(dòng)蛋白（F-actin）相互作用，而C端區(qū)域與多個(gè)蛋白質(zhì)組裝DAPC（Dystrophin-associated protein complex）跨越骨骼和心臟肌肉的肌纖維膜[13]。Dystrophin主要功能是連接肌細(xì)胞中的肌動(dòng)蛋白與細(xì)胞外基質(zhì)，使得肌肉形成緊密的肌肉束，在收縮過(guò)程中保護(hù)肌膜對(duì)抗機(jī)械壓力。DAPC的完整性對(duì)于收縮肌纖維承受由肌膜產(chǎn)生的機(jī)械應(yīng)力以及防止其脆弱的肌膜因收縮引起的損傷至關(guān)重要。此外，Dystrophin必須與糖蛋白結(jié)合成DAGC（Dystrophin-associated glycoprotein complex）才能發(fā)揮穩(wěn)定細(xì)胞膜的作用，有實(shí)例發(fā)現(xiàn)Dystrophin的缺乏使得DAGC復(fù)合體形成失敗，從而不能穩(wěn)定細(xì)胞膜，最終導(dǎo)致肌細(xì)胞壞死[14]。

Dystrophin位于膜和肌動(dòng)蛋白之間，它的破壞會(huì)導(dǎo)致Z線、M線、中間絲狀體斷裂，進(jìn)而會(huì)造成肌纖維之間以及肌纖維與肌膜之間發(fā)生解離，引起肉品質(zhì)構(gòu)劣化[15]。Taylor等[16]研究報(bào)道在牛肉儲(chǔ)存過(guò)程中發(fā)現(xiàn)宰后7 d肌肉中的Dystrophin絕大部分發(fā)生降解。Wojtysia等[17]以閹割公雞與未閹割公雞為原材料研究發(fā)現(xiàn)，發(fā)現(xiàn)宰后48 h后兩組公雞的肌肉纖維中Dystrophin的降解都增加，未閹割雞胸肉中未受損的Dystrophin的含量均高于閹割雞胸肉?？梢?jiàn)，畜禽的生理狀態(tài)對(duì)Dystrophin降解情況也有影響。賈勝男[1]研究發(fā)現(xiàn)，以草魚(yú)背部肌肉組織為實(shí)驗(yàn)材料，第1 d未發(fā)現(xiàn)肌肉中Dystrophin的降解，這表明Dystrophin在動(dòng)物死后前期以完整的形式存在于肌肉中。隨后發(fā)現(xiàn)該蛋白的降解逐日加強(qiáng)，在7 d達(dá)到降解率達(dá)到60%，第21 d時(shí)Dystrophin降解率達(dá)71.14%，滴水損失率與Dystrophin的含量呈顯著負(fù)相關(guān)，Dystrophin的降解最終導(dǎo)致細(xì)胞功能的喪失和肌原纖維結(jié)構(gòu)的削弱，使得持水性受到影響。生理學(xué)中研究發(fā)現(xiàn)，Dystrophin基因變異引起杜氏或貝克爾肌營(yíng)養(yǎng)不良癥，Dystrophin的缺失會(huì)造成肌肉壞死。在肌肉轉(zhuǎn)變成可食用肉的過(guò)程中會(huì)對(duì)肉制品的外觀、營(yíng)養(yǎng)、質(zhì)地等方面帶來(lái)極壞的影響[18]。

表 1 肌肉中的骨架蛋白Table 1 Cytoskeletal proteins in muscle

2.2 網(wǎng)蛋白（Plectin）對(duì)肉持水性的影響

Plectin是血溶素家族的高分子量多功能細(xì)胞骨架蛋白，廣泛分布于動(dòng)物的多種組織細(xì)胞中，如肌肉、皮膚、心臟及腦等。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了16種網(wǎng)蛋白的亞型，其中1d、1f、1b和1四種亞型在肌肉細(xì)胞中表達(dá)量較高。Plectin存在于中間纖維和微絲的質(zhì)膜附著部位，如平滑肌的致密斑塊、心肌的夾層盤(pán)等位置[19]。Plectin位于骨骼肌的Z盤(pán)，骨骼肌中Plectin的分布呈纖維依賴性。通過(guò)旋轉(zhuǎn)跟蹤電子顯微鏡發(fā)現(xiàn)Plectin結(jié)構(gòu)為啞彈狀，Plectin的中心位置是200 μm長(zhǎng)的棒狀結(jié)構(gòu)域，兩側(cè)是兩個(gè)大的球狀結(jié)構(gòu)域[20]。在功能上，作為一種重要的細(xì)胞骨架蛋白，Plectin交聯(lián)細(xì)胞骨架的三種主要成分：微管、中間纖絲和肌動(dòng)蛋白微絲，在穩(wěn)定細(xì)胞結(jié)構(gòu)和維持細(xì)胞功能完整性方面具有重要作用[20]。

Tian等[20]研究表明，豬宰后早期成熟過(guò)程中豬肉Plectin迅速減少并在宰后3 d消失，但是宰后0 h就能檢測(cè)到已經(jīng)被降解為240和20 kDa的Plectin片段快速積累，并證實(shí)Plectin與Desmin一起在重要的肌細(xì)胞部位有規(guī)律的存在，正如圖1所示。這些結(jié)果表明，Plectin在宰后肉品成熟過(guò)程中發(fā)生了迅速而顯著的降解。進(jìn)一步研究通過(guò)比較加入caspase抑制劑與calpain抑制劑，發(fā)現(xiàn)calpain抑制劑能明顯抑制Plectin的降解。在生理上，由Plectin的基因突變導(dǎo)致的Plectin缺乏表現(xiàn)為肌營(yíng)養(yǎng)不良等癥狀，進(jìn)而影響著宰后肉品的質(zhì)量[21]。Plectin的降解會(huì)破壞復(fù)雜的蛋白支架網(wǎng)絡(luò)（圖1），破壞細(xì)胞結(jié)構(gòu)，影響汁液流失通道的形成，最終影響肉品的持水性，因此，研究死后衰老過(guò)程中Plectin降解對(duì)肌肉結(jié)構(gòu)變化和肉質(zhì)的影響是很有必要的。

圖 1 骨架蛋白位置及降解機(jī)制Fig.1 Cytoskeleton proteins location and degradation mechanism

2.3 踝蛋白（Talin）對(duì)肉持水性的影響

Talin作為一個(gè)大分子量蛋白，位于細(xì)胞膜的內(nèi)表面，由2541個(gè)氨基酸組成，長(zhǎng)度約為60 nm，大小270 kDa[22]。Talin由50 kDa N端頭部區(qū)域和220 kDa兩性分子螺旋束組成的細(xì)長(zhǎng)棒體組成。Talin頭部包含一個(gè)FERM結(jié)構(gòu)域，含有FERM結(jié)構(gòu)域的蛋白質(zhì)在許多生物學(xué)過(guò)程中都是必不可少的，包括細(xì)胞粘附、運(yùn)動(dòng)、增殖和分化[23]。含有FERM結(jié)構(gòu)域的Talin在細(xì)胞粘附受體整合素家族的激活中起關(guān)鍵作用，并且為β-Intergrin亞基和肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架之間提供直接聯(lián)系。Talin作為粘著斑成分介于肌動(dòng)蛋白和Intergrin之間，而Vinculin是與黏著斑有關(guān)的主要細(xì)胞骨架蛋白，Vinculin在胞內(nèi)過(guò)表達(dá)可使黏著斑更加穩(wěn)定[24?25]。

先前Kristensen等[6]對(duì)Talin的研究表明，Talin發(fā)生快速降解，骨骼肌膜結(jié)構(gòu)被破壞，隨后肌纖維收縮時(shí)產(chǎn)生的交聯(lián)及肌原纖維之間的交聯(lián)斷裂，擠壓細(xì)胞內(nèi)水分的力被消除，使肌肉的持水能力提高。發(fā)生此結(jié)果的原因可能是骨架蛋白質(zhì)的降解使肌細(xì)胞橫向膨脹。Melody等[26]研究發(fā)現(xiàn)，Talin宰第1 d開(kāi)始降解，Kristensen等[6]研究發(fā)現(xiàn)，宰后第4 d Talin降解達(dá)到了68%。Tomisaka等[27]研究了宰后肌肉系水力的變化，發(fā)現(xiàn)Talin在宰后第4 d降解為最初的25%。Huff-Lonergan等[28]研究發(fā)現(xiàn)Talin的降解能減少肌肉的汁液流失率。而楊汝男等[29]測(cè)定了RFN（Reddish，F(xiàn)irm，Non-exudative）與PSE（Pale，Soft，Exudative）肉樣中Talin的降解量，發(fā)現(xiàn)宰后各時(shí)間點(diǎn)Talin的含量與汁液流失率呈不顯著正相關(guān)（P>0.05），Talin的降解對(duì)持水性無(wú)影響。目前，宰后肉品Talin降解與汁液流的關(guān)系仍存在較大爭(zhēng)議[30]，Talin對(duì)肌肉持水性影響還有待進(jìn)一步研究確認(rèn)。

2.4 肌間線蛋白（Desmin）對(duì)肉持水性的影響

Desmin是中間纖維的重要基礎(chǔ)結(jié)構(gòu)，它的亞基分子量為55 kDa，圍繞Z盤(pán)分布并延伸到Z盤(pán)內(nèi)部，是位于Z線以及Z線和肌細(xì)胞膜之間的骨架蛋白，由兩端的N端和C端以及中間螺旋桿狀結(jié)構(gòu)（αlelical rod）組成[31]。Desmin通過(guò)Z線將單個(gè)肌原纖維連接在一起，使得收縮運(yùn)動(dòng)機(jī)械整合在一起，同時(shí)連接線粒體、細(xì)胞核和肌膜，主要為限制肌節(jié)在肌肉收縮時(shí)過(guò)分拉伸。此外，Desmin幫助鄰近肌原纖維正確定位和排列，在成熟的肌細(xì)胞中連接每條肌原纖維并將其與細(xì)胞膜聯(lián)結(jié)，發(fā)揮著固定肌原纖維的作用，進(jìn)而維持整個(gè)骨骼肌細(xì)胞的有序性和完整性[26]。

Desmin的重要功能決定了其可能對(duì)宰后肉品的持水性起重要作用。Desmin在4 ℃環(huán)境中能夠迅速發(fā)生降解，使肌原纖維間的橫橋交聯(lián)斷裂，導(dǎo)致肌原纖維有序結(jié)構(gòu)被破壞，從而提高持水性。張冬怡等[32]人發(fā)現(xiàn)Desmin降解程度、鈣蛋白酶自溶程度及汁液流失率呈正相關(guān)。此外還發(fā)現(xiàn)，PSE肉中Desmin開(kāi)始發(fā)生降解的時(shí)間先于RFN肉，說(shuō)明PSE肉中Desmin的降解導(dǎo)致的肌原纖維的結(jié)構(gòu)破壞快于RFN肉，PSE肉對(duì)肉品持水性影響更大。有研究發(fā)現(xiàn)Desmin宰后第1 d未發(fā)生降解，到了第4 d才發(fā)生輕微降解，到第10 d降解了70%。在7 d后，由于骨架蛋白質(zhì)的降解使得肌細(xì)胞橫向膨脹導(dǎo)致持水性增加[3]。鄭偉的研究中發(fā)現(xiàn)宰后豬肉樣品1~7 h的Desmin完整度與汁液流失均無(wú)顯著相關(guān)性，這與其他人研究結(jié)果不一致[33]。王穎等[34]研究發(fā)現(xiàn)，Desmin的含量在高極限pH后2 d內(nèi)顯著持續(xù)下降，在中極限pH組中明顯下降至宰后5 d，而在低極限pH組中宰后7 d內(nèi)一直持續(xù)顯著下降。由此可見(jiàn)，Desmin在高極限pH的情況下降解速度更快。由上述所知，Desmin降解程度與肉品溫度、pH、蛋白酶等因素共同作用影響著肉品的持水性。

2.5 整合素（Intergrin）對(duì)肉持水性的影響

Intergrin是一類(lèi)異二聚跨膜蛋白，是由內(nèi)而外和由外而內(nèi)的信號(hào)通路介導(dǎo)細(xì)胞與細(xì)胞外環(huán)境之間的信息傳遞者[5]。如圖1所示，Intergrin位于肌膜上，穿過(guò)膜內(nèi)外與其他骨架蛋白結(jié)合發(fā)生作用。Intergrin分子是由兩個(gè)子單元稱為α（120~185 kDa）和β（90~110 kDa），迄今為止，超過(guò)24種不同的α和β鏈的組合已被識(shí)別，導(dǎo)致細(xì)胞外蛋白識(shí)別的高特異性[35]。β鏈主要負(fù)責(zé)細(xì)胞膜與細(xì)胞體的結(jié)合，而α鏈則更多地參與了與基質(zhì)的相互作用。Intergrin的主要功能是細(xì)胞與基質(zhì)的粘附和細(xì)胞間的接觸，Intergrin作為一種膜受體，通過(guò)傳遞細(xì)胞環(huán)境的結(jié)構(gòu)和組成信息，參與信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)和細(xì)胞對(duì)微環(huán)境信號(hào)的反應(yīng)[36]。Intergrin與細(xì)胞骨架有許多信號(hào)通路，如MAPK信號(hào)通路、RHO介導(dǎo)的信號(hào)通路、整合素-肌動(dòng)蛋白間信號(hào)通路等[37]。研究發(fā)現(xiàn)，在由胞內(nèi)向胞外傳導(dǎo)信號(hào)的過(guò)程中，Talin在調(diào)節(jié)Intergrin胞外結(jié)構(gòu)域結(jié)合配體親和力上起著關(guān)鍵的作用。Talin與Intergrin亞基的胞質(zhì)結(jié)構(gòu)域結(jié)合，形成長(zhǎng)C端桿結(jié)構(gòu)域，與肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架形成多重連接。Talin頭域通過(guò)與細(xì)胞質(zhì)尾部結(jié)合激活整合素β-integrin和酸性膜磷脂。磷脂酰肌醇4,5-二磷酸（PIP2）可增強(qiáng)Talin在質(zhì)膜上的附著，從而誘導(dǎo)Talin構(gòu)象改變，暴露Intergrin結(jié)合位點(diǎn)[38]。

有個(gè)形成滴水通道的假說(shuō)：在屠宰后的最初幾個(gè)小時(shí)內(nèi)，胴體進(jìn)入僵直狀態(tài)，肌肉纖維收縮，水從各個(gè)肌原纖維之間被擠出，肌肉纖維表面的鈣蛋白酶被激活，Intergrin被降解，細(xì)胞膜脫離纖維，形成滴水通道，然后，水會(huì)填補(bǔ)這些空隙，并很容易以水滴的形式流失[39]。然而，如果calpain介導(dǎo)的Intergrin降解發(fā)生在開(kāi)始變硬之后，那么從纖維中擠出的水分就會(huì)被排出到周?chē)慕Y(jié)締組織中。由于結(jié)締組織本身具有固有的鎖水能力，液體更好地保留在組織中，最終滴水損失減少[40]。李華健等[41]研究表明宰后3、9、24 h肉品的汁液流失率與Intergrin的表達(dá)水平呈顯著負(fù)相關(guān)。隨著宰后豬肉中pH的降低，Intergrin的降解會(huì)增加汁液流失。由于Intergrin是跨膜蛋白，如圖1所示，Intergrin的降解會(huì)造成膜和黏附結(jié)構(gòu)被破壞，肌細(xì)胞/膜的相互作用減弱，形成汁液通道，增加汁液流失。Zhang等[42]報(bào)道，宰后24 h Intergrin的完整性與宰后24及120 h的滴水損失呈顯著負(fù)相關(guān)，相關(guān)系數(shù)分別是?0.3022和?0.2864。Intergrin的降解，尤其是Intergrin的β亞基的降解，削弱了細(xì)胞膜與細(xì)胞的黏附作用，導(dǎo)致水分更容易從細(xì)胞膜與細(xì)胞的縫隙中流失。在肌肉組織中，從細(xì)胞骨架到細(xì)胞外基質(zhì)的連續(xù)連接是由兩個(gè)特定的蛋白質(zhì)家族組成的，它們分別是肌營(yíng)養(yǎng)不良蛋白/肌營(yíng)養(yǎng)不良聚糖復(fù)合物和Intergrin。細(xì)胞膜通過(guò)兩種主要類(lèi)型的粘附復(fù)合物附著在細(xì)胞體上，這兩種粘附復(fù)合物是含Intergrin的局灶性粘附和蛋白的營(yíng)養(yǎng)不良蛋白/營(yíng)養(yǎng)不良聚糖合物。Intergrin是負(fù)責(zé)細(xì)胞膜粘附在細(xì)胞骨架上的主要成分之一[5]。從以上研究可知，Intergrin的特殊位置對(duì)肉品的汁液流失影響較大，在形成汁液流失通道中有著重要的作用。

3 影響骨架蛋白降解的因素

3.1 鈣蛋白酶系統(tǒng)（calpain）

鈣蛋白酶啟動(dòng)骨架蛋白的降解，在肉質(zhì)調(diào)控方面發(fā)揮著重要作用，圖1就顯示著鈣蛋白的降解作用。鈣蛋白酶主要位于肌肉纖維Z盤(pán)附近和肌質(zhì)網(wǎng)膜上，calpain蛋白分解系統(tǒng)至少包括4種成分。其中：微摩爾濃度的鈣離子可激活μ-calpain，也稱為calpain-1；calpain-2是只有毫摩爾濃度的鈣離子可激活，也稱m-calpain；calpain-3是骨骼肌中特有的酶，存在于帶皮的纖維和骨骼肌肌漿中，可被鈣離子激活；calpastatin，它是μ-calpain和m-calpain的抑制蛋白，是鈣激活蛋白酶的抑制因子，對(duì)調(diào)控calpain的活性有重要作用。屠宰后，肌肉肌漿內(nèi)鈣離子濃度升高，鈣蛋白酶發(fā)生自溶，μ-calpain和m-calpain都由80 kDa大亞基分別變成了76和78 kDa亞基，2種鈣蛋白酶的28 kDa的亞基降解為18 kDa的亞基。鈣蛋白酶自溶后則發(fā)揮活性，啟動(dòng)了肌肉蛋白質(zhì)的降解。因此，調(diào)控鈣離子濃度對(duì)鈣蛋白酶的激活有重要的意義[43]。鈣蛋白破壞肌肉超微結(jié)構(gòu)、Z線弱化并消失，促進(jìn)肌原纖維小片化，改善肌肉嫩度和持水性。Bee[44]等報(bào)道，高pH更容易激活μ-鈣蛋白酶的自溶，生成更多的76 kDa亞基，啟動(dòng)細(xì)胞蛋白質(zhì)降解。鈣蛋白酶自溶后，降解蛋白質(zhì)，但鈣蛋白酶的活性位點(diǎn)含有組氨酸和半胱氨酸殘基，很容易受到自由基的攻擊而失活或活性降低[45]。

3.2 組織蛋白酶（lysosomal cathepsins）

組織蛋白酶是參與細(xì)胞內(nèi)蛋白質(zhì)分解代謝以及其他各種生理和病理過(guò)程的溶酶體肽酶[46]。組織蛋白酶存在于溶酶體中，溶酶體被破壞后釋放出組織蛋白酶參與蛋白的水解過(guò)程。與鈣蛋白酶相比，組織蛋白酶在宰后胴體pH下降后中發(fā)揮著重要的作用[47]。豐永紅等[48]研究發(fā)現(xiàn)，畜禽在宰后成熟過(guò)程中，組織蛋白酶的活性基本呈現(xiàn)先升高后下降的趨勢(shì)，組織蛋白酶B、L活性遠(yuǎn)高于組織蛋白酶H活性。組織蛋白酶L活性較組織蛋白酶B活性更高，蛋白水解作用更大。Baron等[49]實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，鈣蛋白酶會(huì)先破壞Desmin的結(jié)構(gòu)，組織蛋白酶會(huì)將產(chǎn)物降解為更小的肽類(lèi)。顏龍杰等[50]研究凡納濱對(duì)蝦組織蛋白酶L對(duì)肌肉蛋白降解過(guò)程中發(fā)現(xiàn)，分子量大于60 kDa的蛋白均出現(xiàn)降解，其中肌球蛋白重鏈最先發(fā)生降解，并在180 min之內(nèi)基本降解完全。可見(jiàn)組織蛋白酶在宰后成熟中降解肌原纖維發(fā)揮著重要的作用。研究表明，在應(yīng)激過(guò)程中pH下降，可能促進(jìn)溶酶體、線粒體和肌原纖維的膜通透性解體，使得組織蛋白酶快速釋放到肌原纖維中，促進(jìn)肌肉降解[51]。這就解釋了組織蛋白酶存在于溶酶體中不能與肌原纖維快速接觸卻能夠被其降解的原因。

3.3 細(xì)胞凋亡酶（caspase）

細(xì)胞凋亡酶是半胱氨酸蛋白酶，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了14種，主要在細(xì)胞凋亡過(guò)程中發(fā)揮作用。宰后肌肉細(xì)胞主要是以凋亡的方式死亡且細(xì)胞凋亡酶3、6和7等參與細(xì)胞蛋白質(zhì)的降解，也參與宰后肉品成熟過(guò)程。有實(shí)驗(yàn)證明，細(xì)胞凋亡酶3、7和9在宰后0和32 h的活性變化比率與肉的嫩度顯著相關(guān)[52]，而前文提到嫩度與肉品的持水性有相關(guān)性，從而細(xì)胞凋亡酶對(duì)持水性有一定的影響作用。將細(xì)胞凋亡酶3與肌原纖維蛋白進(jìn)行體外孵育發(fā)現(xiàn)，肌鈣蛋白和Desmin等會(huì)出現(xiàn)降解。自然成熟條件下，加入caspase-3的專(zhuān)一性抑制劑可以抑制Desmin、伴肌動(dòng)蛋白等的降解。隨著宰后時(shí)間的延長(zhǎng)，caspase-3逐漸失活，并且活性變化與剪切力變化之間相關(guān)性不顯著[53]。賈青等[54]在牦牛肉中加入caspase-3抑制劑（Ac-DEVD-CHO）觀察肌原纖維降解，實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)宰后12 h后caspase-3抑制劑對(duì)牦牛肌原纖維降解抑制效果顯著。宰后120 h后肌原纖維出現(xiàn)不同程度降解，caspase-3抑制劑幾乎無(wú)抑制效果。而Tian等[20]人的研究發(fā)現(xiàn)，加入caspase-3抑制劑（Ac-DEVDCHO）處理組和對(duì)照組肉品相比，未見(jiàn)完整Plectin和降解Plectin的顯著差異，可以推測(cè)完整Plectin及其降解產(chǎn)物可能不是死后豬肉中caspase-3的底物。對(duì)于加入calpain抑制劑（MDL-28170）的處理組，含有抑制劑中有明顯高強(qiáng)度的完整的Plectin，而對(duì)照組中幾乎消失，說(shuō)明Plectin的降解主要是由calpain降解的。由上所知，細(xì)胞凋亡酶能夠加速肌鈣蛋白和Desmin的降解，對(duì)Plectin無(wú)明顯降解作用。因此，細(xì)胞凋亡酶對(duì)蛋白降解底物具有選擇性和特異性。

3.4 蛋白質(zhì)亞硝基化

蛋白質(zhì)亞硝基化是指一氧化氮及其衍生物修飾蛋白質(zhì)中的半胱氨酸殘基生成亞硝基硫醇的過(guò)程。蛋白質(zhì)亞硝基化能夠降低骨架蛋白對(duì)鈣離子的敏感性以及抑制肌球蛋白ATP酶的活性[55]，主要通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，鈣蛋白酶需要鈣離子的激活才能發(fā)揮水解活性，最終影響著蛋白的降解。李玉品[56]等人研究發(fā)現(xiàn)GSNO（一氧化氮供體亞硝基谷胱甘肽）修飾的肌原纖維蛋白改變了其對(duì)鈣蛋白酶的敏感性，提高了Desmin和肌聯(lián)蛋白降解程度（P<0.05），抑制了肌鈣蛋白的降解程度（P<0.05）。張朝陽(yáng)[57]等用GSNO和一氧化氮合成酶抑制劑N-單甲基-L精氨酸乙酸酯（L-NAME）調(diào)控宰后成熟過(guò)程中牛肌肉細(xì)胞內(nèi)一氧化氮的含量，探究蛋白質(zhì)亞硝基化對(duì)牛肉品質(zhì)的影響。通過(guò)電鏡觀察肌纖維結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，在成熟第7 d，與對(duì)照組GSNO處理組相比，L-NAME處理組的肌纖維M線已不可辨認(rèn)、Z線模糊不清、結(jié)構(gòu)完整度下降。這表明蛋白質(zhì)亞硝基化能夠提高牛肉中蛋白質(zhì)的氧化水平，減少肌纖維結(jié)構(gòu)的破壞。L-NAME處理降低了蛋白質(zhì)硝基化程度，可以降低牛肉的極限pH和持水力，提高牛肉嫩度和亮度值。

3.5 熱休克蛋白（HSPs）

熱休克蛋白是蛋白質(zhì)組裝與拆卸、蛋白質(zhì)折疊與展開(kāi)以及受損蛋白的再折疊過(guò)程中必不可少的分子伴侶。它們?cè)诒Ｗo(hù)細(xì)胞和結(jié)構(gòu)方面發(fā)揮重要作用，并具有抗凋亡活性[58]。HSP有5大類(lèi)，分別為小分子量HSP家族（泛素、HSP10、αβ-crystallin、HSP27、HSP32、HSP27）、中等分子量HSP家族、HSP70家族、HSP90家族和HSP110家族，其中αβ-crystallin是sHSP家族中的重要成員，它保護(hù)細(xì)胞骨架蛋白免受各種應(yīng)激因素的損傷、防止蛋白變性和使變性的蛋白恢復(fù)折疊，具有分子伴侶作用，HSP27也可參與細(xì)胞的增殖、分化及細(xì)胞凋亡的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)調(diào)節(jié)等。HSP27對(duì)ROS（Reactive oxygen species）有抑制作用，也可以表達(dá)為對(duì)骨架蛋白的保護(hù)作用，減少蛋白的降解[59]。Balan等[60]以低、中、高pH的牛肉研究sHSP對(duì)肌肉質(zhì)量的影響，發(fā)現(xiàn)宰后第1 d，與低pH牛肉相比，在中pH牛肉中觀察到更完整的sHSPs。此外，sHSP 20和27的降解與肌原纖維蛋白Desmin和肌鈣蛋白的降解之間存在高度顯著的相關(guān)性。孫金龍等[61]在研究HSP27對(duì)肌原纖維影響時(shí)發(fā)現(xiàn)HSP27能夠通過(guò)抑制caspase-3、caspase-9的活性來(lái)抑制肌原纖維小片化的發(fā)生和Desmin和肌鈣蛋白的降解。同時(shí)發(fā)現(xiàn)，Hsp27能夠抑制μ-鈣激活酶和Caspase-3對(duì)肌原纖維蛋白的降解，如圖1所示。

4 結(jié)論

持水性影響著肉品的加工特性、感官性質(zhì)和經(jīng)濟(jì)效益。肌肉纖維的結(jié)構(gòu)變化與肌肉的持水性密切相關(guān)，其中骨架蛋白的降解直接影響到肉品的持水性，本文主要探究了Dystrophin、Plectin、Desmin、Talin、Intergrin等近年來(lái)研究發(fā)現(xiàn)的主要骨架蛋白的作用機(jī)制及對(duì)肉品持水性的影響。鈣蛋白酶、組織蛋白酶、細(xì)胞凋亡酶、蛋白質(zhì)亞硝基化、熱休克蛋白等，這些因素形成了一個(gè)復(fù)雜系統(tǒng)共同影響著骨架蛋白的降解。

目前對(duì)于影響骨架蛋白降解的因素以及骨架蛋白與肉品持水性關(guān)系的研究還有待進(jìn)一步研究確認(rèn)，蛋白酶系統(tǒng)的交互作用對(duì)于肌肉持水性的影響仍舊是亟需探索的研究方向。通過(guò)調(diào)控宰后肉品的骨架蛋白降解，提高肉品的持水性，獲得優(yōu)良的肉產(chǎn)品，是肉品行業(yè)重要的研究方向。