秀珍菇菌絲活化培養(yǎng)條件優(yōu)化

林 童 周燈銀 馬 博 王壽容 吳智艷，2，3 解春艷*

（1廊坊師范學(xué)院生命科學(xué)學(xué)院，河北廊坊065000；2河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心，河北廊坊065000；3廊坊市微生物發(fā)酵研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊065000；4廊坊市食品營養(yǎng)與安全重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北廊坊065000）

秀珍菇Pleurotus geesteranus，是常見的食用菌之一，味道鮮美，蛋白質(zhì)含量豐富，營養(yǎng)價值與牛奶相當(dāng)，含有人體所需的8種必需氨基酸及多種礦質(zhì)元素，營養(yǎng)價值極高[1-3]。秀珍菇屬于白腐真菌之一，吸收由自身分泌胞外酶裂解基質(zhì)成小分子物質(zhì)完成營養(yǎng)生長和生殖生長，即由胞外木質(zhì)素酶及纖維素酶來分解基質(zhì)中的木質(zhì)纖維素作為自身所需的營養(yǎng)物質(zhì)[4-7]。而秀珍菇菌絲分泌胞外酶的能力與培養(yǎng)基成分（如碳源、氮源、pH等）及培養(yǎng)周期有密切的關(guān)聯(lián)。

固態(tài)發(fā)酵是微生物在無游離水或游離水含量極低的環(huán)境中生長的過程。在這個過程中，固態(tài)基質(zhì)可以看作是微生物整個生長代謝過程中營養(yǎng)和能量的來源，是微生物生長中必不可少的重要依存物質(zhì)[8-9]。固態(tài)發(fā)酵對人類飲食的歷史重要性可以追溯到幾千年前，如西方國家的面包、奶酪制作及東方國家的酒曲。與液體發(fā)酵相比，固態(tài)發(fā)酵具有設(shè)備構(gòu)造簡單、能耗低、易操作、污染少等特點(diǎn)。食用菌固態(tài)發(fā)酵經(jīng)過多年的發(fā)展，在農(nóng)業(yè)、食品、工業(yè)、環(huán)境、能源等有重要的應(yīng)用價值[10-13]。秀珍菇為常見的食用菌之一，可以利用其菌絲胞外酶特性固態(tài)發(fā)酵谷物等糧食作物，提高谷物的營養(yǎng)價值，具有投資少、成本低、可大規(guī)模生產(chǎn)等優(yōu)點(diǎn)，促進(jìn)谷物的精深加工。

觀測秀珍菇菌絲的生長特性、胞外酶活性及菌絲生長周期等，探尋固態(tài)發(fā)酵前秀珍菇活化的最佳菌絲狀態(tài)，以期獲得最佳的秀珍菇活化培養(yǎng)條件，提高其各方面性能，促進(jìn)固態(tài)發(fā)酵效率，為秀珍菇固態(tài)發(fā)酵谷物等糧食作物提供借鑒，也為其他食用菌固態(tài)發(fā)酵、理化性質(zhì)的研究及新品種的選育提供科學(xué)的依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試秀珍菇菌株080009，引自河北省食藥用菌資源高值利用技術(shù)創(chuàng)新中心。土豆購于廊坊元辰超市。其他試劑：酵母粉、蛋白胨、乳糖、蔗糖、硝酸銨、鹽酸、苯酚、濃硫酸、氫氧化鈉、葡萄糖、羥甲基纖維素鈉、二硝基水楊酸法（DNS）等均購自天津鼎國生物技術(shù)有限公司。

1.2 主要儀器設(shè)備

BPC-150生化培養(yǎng)箱，上海一恒科學(xué)儀器有限公司；TD5A-WS低速離心機(jī)，長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司；PHS-25-01型pH計，上海盛磁儀器有限公司；BAS224S賽多利斯電子天平，賽多利斯科學(xué)儀器（北京）制造有限公司；DHG-9070鼓風(fēng)干燥箱，中儀國科（北京）科技有限公司；SW-CJ-2FD超凈工作臺，蘇凈安泰空氣技術(shù)有限公司；HH-4數(shù)顯恒溫水浴鍋，上海力辰邦西儀器科技有限公司；L3L4物聯(lián)智能紫外可見分光光度計，上海佑科儀器儀表有限公司；OLB-2102C恒溫振蕩器，濟(jì)南敏創(chuàng)生物科技有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備

PDA培養(yǎng)基：馬鈴薯200 g，葡萄糖20 g，瓊脂20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.01 g，蒸 餾水1 000 mL，pH自然。

加富PDA培養(yǎng)基：PDA培養(yǎng)基中加入5 g/L蛋白胨。

無氮培養(yǎng)基：葡萄糖20 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

無碳培養(yǎng)基：蛋白胨5 g，KH2PO43 g，MgSO41.5 g，VB10.01 g，瓊脂20 g，蒸餾水1 000 mL，pH自然。

液體培養(yǎng)基：上述固體培養(yǎng)基中去除瓊脂。所有培養(yǎng)基均經(jīng)121℃20 min高溫高壓滅菌后使用。

1.3.2 菌絲培養(yǎng)及檢測

利用PDA平板培養(yǎng)基初步活化秀珍菇菌絲體，待菌絲長滿平板，挑選生長狀態(tài)良好的菌絲，用直徑0.8 cm打孔器制作菌餅，放入新的平板中央，于26℃恒溫生化培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，每個條件4個重復(fù)。用十字交叉法每天固定時間測量菌落的直徑，同時觀察菌絲生長情況，直至菌絲長滿平板。

秀珍菇菌絲體活化后，用直徑0.8 cm打孔器制作菌餅，放入含100 mL液體培養(yǎng)基的錐形瓶中，每個錐形瓶放5塊菌餅，26℃150 r/min振蕩培養(yǎng)，3個重復(fù)。發(fā)酵結(jié)束后發(fā)酵液離心，取上清液測酶活，取沉淀的菌絲體烘干，稱重。

1.3.3 不同氮源對秀珍菇菌絲生長的影響

在無氮培養(yǎng)基中分別加入5 g/L的蛋白胨、硫酸銨、硝酸鉀和酵母粉，以無氮培養(yǎng)基、PDA和加富PDA為對照。觀察秀珍菇菌絲的生長狀態(tài)，初步確定氮源。

1.3.4 不同碳源對秀珍菇菌絲生長的影響

在無碳培養(yǎng)基中分別加入20 g/L的乳糖、麥芽糖、淀粉、蔗糖和葡萄糖，以無碳培養(yǎng)基為對照。觀察秀珍菇菌絲的生長狀態(tài)，確定最佳碳源。

1.3.5 不同pH對秀珍菇菌絲生長的影響

加富PDA培養(yǎng)基用1 mol/L鹽酸或氫氧化鈉調(diào)節(jié)其pH分別為5.0、6.0、7.0、8.0、9.0、10.0。觀察秀珍菇菌絲的生長狀態(tài)，確定最佳pH。

1.3.6 木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的酶活性測定

1.3.6.1 纖維素酶活性測定

葡萄糖標(biāo)曲的繪制：采用二硝基水楊酸法（DNS）測定葡萄糖含量[14-16]。在540 nm條件下測定不同濃度葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液的吸光度值，繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線。

羧甲基纖維素酶活性測定：在試管中加入1.5 mL 0.5%的羧甲基纖維素鈉溶液（0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液配制）[17]，加入0.5 mL粗酶液，50℃水浴30 min后，采用DNS法測定上清液中葡萄糖的含量，以煮沸滅活15 min的酶液做對照。每個樣品3次重復(fù)。

半纖維素酶活性測定：在試管中加入1.5 mL 0.5%的木聚糖溶液（0.1 mol/L醋酸鹽緩沖液配制）[17]，加入0.5 mL粗酶液，50℃水浴30 min后，采用DNS法測定上清液中葡萄糖的含量，以煮沸滅活15 min的酶液做對照。每個樣品3次重復(fù)。

1.3.6.2 多酚氧化酶活性測定

采用鄰苯二酚法測定多酚氧化酶活性[18]。取1 mL 0.1 mol/L鄰苯二酚，加入5 mL磷酸鹽緩沖液（pH 6.9），混勻，30℃水浴10 min，加入1 mL粗酶溶液，快速搖勻，以煮沸滅活15 min的酶液作為參比液，采用分光光度計于波長410 nm處測定溶液的吸光度。每30 s記錄1次，共測定3 min。以1 mL酶液，1 min內(nèi)增加的吸光度表示酶活性的強(qiáng)弱。

1.3.6.3 愈創(chuàng)木酚酶活性測定

采用比色法測定愈創(chuàng)木酚酶活性[18]。取0.08 mol/L愈創(chuàng)木酚溶液0.5 mL，加入0.1 mL粗酶液，以沸水滅活粗酶液為對照，加入2 mL 0.05 mol/L磷酸鹽緩沖液（pH6），混勻后490 nm處測定溶液的吸光度值，每30 s記錄1次。

1.3.6.4 漆酶活性測定

采用ABTS法測定漆酶活性[19]。1 mL粗酶液加入2 mL 0.25 mmol/L的ABTS緩沖液，反應(yīng)3 min，分光光度計測410 nm波長處OD值。每30 s記錄1次，定義每分鐘使OD均值增加0.1所需的酶量為1個酶活力單位（U），計算酶活性。

1.3.6.5 淀粉酶活性測定

采用DNS法測定淀粉酶活性[20]。將0.5 mL 0.1 mol/L檸檬酸緩沖液（pH5.6）和0.5 mL粗酶液混合，40℃水浴15 min，加入1 mL預(yù)熱的1%可溶性淀粉混勻，40℃水浴5 min后加入2 mL 0.4 mol/L NaOH混勻，取等量的混合液與DNS試劑混合定容，測吸光度值變化。

2 結(jié)果與分析

2.1 培養(yǎng)基氮源篩選

由圖1可知，固體培養(yǎng)基為PDA、加富PDA、蛋白胨和酵母粉時，菌落生長速度較快，但加富PDA菌落邊緣生長不整齊（表1），而氮源為硫酸銨、硝酸鉀及無氮源的培養(yǎng)基培養(yǎng)上，菌絲生長較慢，說明氮源影響菌絲的生長速度。此外，PDA培養(yǎng)基和加富PDA培養(yǎng)基中雖然菌絲生長速度較快，但是菌絲密度較密（表1），菌絲活力弱，而以蛋白胨和酵母粉為氮源時，菌絲生長速度快且菌絲濃密，活力強(qiáng)，第7天菌落直徑分別為8.07 cm和8.12 cm，兩者相差不大，因此，蛋白胨和酵母粉都有利于秀珍菇菌絲生長。

圖1 不同氮源培養(yǎng)基上秀珍菇菌絲菌落直徑

表1 不同氮源培養(yǎng)基上秀珍菇菌絲生長情況

2.2 培養(yǎng)基碳源篩選

從菌落直徑看，乳糖為碳源時菌落增長最緩慢，其他四種碳源的菌落增長都相對較快（圖2），然而菌絲的生長狀況卻有很大差異。由表2可知，淀粉和葡萄糖為碳源時，菌絲生長濃密，邊緣整齊，菌絲活力強(qiáng)，而碳源為麥芽糖和蔗糖時，菌絲密度一般，活力不如淀粉和葡萄糖的菌絲，乳糖為碳源的菌絲最差，菌絲稀疏。從第7天的菌落直徑看，淀粉或葡萄糖為碳源時菌落直徑分別為7.92 cm和8.69 cm，差距不是很大，綜合考慮最終確定碳源為葡萄糖。

圖2 不同碳源培養(yǎng)基上秀珍菇菌落直徑

表2 不同碳源培養(yǎng)基上秀珍菇菌絲生長情況

2.3 培養(yǎng)基p H篩選

由圖3可以看出，培養(yǎng)基呈堿性時，秀珍菇菌落直徑增長較快，但菌絲稀疏（表3）；呈弱酸性（pH6）或中性（pH7）時，菌絲生長潔白濃密，活力較強(qiáng)，pH自然值時，菌絲生長較密，優(yōu)于堿性培養(yǎng)基。因此，培養(yǎng)基的pH以弱酸性或中性比較合適，具體pH數(shù)值還需要進(jìn)一步篩選。

圖3 p H不同的培養(yǎng)基上秀珍菇菌落直徑

表3 p H不同的培養(yǎng)基上秀珍菇菌絲生長情況

2.4 培養(yǎng)基氮源最終篩選

根據(jù)固體培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果，確定培養(yǎng)基碳源為葡萄糖，為進(jìn)一步確定最佳氮源，進(jìn)行液體培養(yǎng)比較，以菌絲體生物量、菌絲胞外酶活性為考察指標(biāo)。

由圖4可知，相同液體培養(yǎng)（發(fā)酵）周期內(nèi)，以蛋白胨為氮源的菌絲生物量為（5.42±0.14）g/L，而以酵母粉為氮源菌絲生物量為（7.70±0.10）g/L，且酵母粉為氮源時菌絲球更加均勻。

圖4 兩種氮源培養(yǎng)基中菌絲生物量

由圖5可知，兩種氮源的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)秀珍菇菌絲的半纖維素酶、愈創(chuàng)木酚酶活性差異不大，而酵母粉為氮源的液體培養(yǎng)基培養(yǎng)秀珍菇菌絲的胞外羧甲基纖維素酶、多酚氧化酶、漆酶和淀粉酶酶活性稍高于氮源為蛋白胨。因此，氮源為酵母粉時培養(yǎng)秀珍菇效果最佳，菌絲生長濃密、長速較快，且胞外酶活性更強(qiáng)。

圖5 兩種氮源培養(yǎng)基中胞外酶活性

2.5 培養(yǎng)基p H最終篩選

培養(yǎng)基以葡萄糖為碳源，酵母粉為氮源，依據(jù)固體培養(yǎng)基試驗(yàn)結(jié)果，分別調(diào)節(jié)液體培養(yǎng)基pH為5、6、7。

由圖6可知，當(dāng)液體培養(yǎng)基pH為5、6、7時，秀珍菇菌絲生物量分別為（7.57±0.42）g/L、（9.34±0.22）g/L、（11.475±0.36）g/L，pH中性時菌絲生物量最高。由圖7可知，pH為7時，菌絲胞外酶活性相對較高，其次是pH為6，pH為5時，除羧甲基纖維素酶外，其他酶活性相對較低。因此，最終確定培養(yǎng)基的pH為7，此時的秀珍菇菌絲生長較好，活力強(qiáng)，且菌絲胞外酶活性較高。

圖6 不同p H的液體培養(yǎng)基中菌絲生物量

圖7 不同pH的液體培養(yǎng)基中菌絲胞外酶活性

2.6 秀珍菇菌絲培養(yǎng)周期篩選

秀珍菇液體培養(yǎng)周期也會影響其菌絲體的活力，培養(yǎng)周期短，菌絲生物量低，最終影響固態(tài)發(fā)酵周期，而培養(yǎng)周期太長，菌絲老化，活力下降，也會影響后期固體發(fā)酵效率。

由圖8可知，液體培養(yǎng)第4天開始，菌絲生物量隨著培養(yǎng)時間的延長，逐漸增多。由圖9可知，培養(yǎng)第6天，半纖維素酶、羧甲基纖維素酶、愈創(chuàng)木酚酶活性最高，多酚氧化酶活性在第8天最高，淀粉酶活性第5天最高，此后一直下降。因此，秀珍菇培養(yǎng)周期6 d為佳，此時與木質(zhì)纖維素降解相關(guān)的大部分酶活性最高，說明此時的菌絲活力最強(qiáng)。

圖8 不同培養(yǎng)周期菌絲生物量

圖9 不同培養(yǎng)周期菌絲胞外酶活性

3 小結(jié)

氮源、碳源、pH和培養(yǎng)周期都會影響秀珍菇菌絲體的活力，通過平板培養(yǎng)觀測菌絲體生長狀態(tài)，初步確定菌絲活化最佳碳源為葡萄糖，而氮源為蛋白胨和酵母粉時差異較小，且pH在弱酸性或中性條件下菌絲生長最佳。之后的液體培養(yǎng)進(jìn)一步確定秀珍菇菌絲活化最佳氮源為酵母粉，碳源為葡萄糖，pH為7.0。通過菌絲體培養(yǎng)周期的生長曲線和菌絲胞外酶活性，最終確定發(fā)酵6 d時菌絲活力最佳，且菌絲胞外酶活性最強(qiáng)。

試驗(yàn)明晰了秀珍菇菌絲活化最佳的碳源、氮源、pH和培養(yǎng)周期，為后期秀珍菇高效固體發(fā)酵提供保障，同時可為其他食用菌菌種選育、活化及理化性質(zhì)的研究提供參考。