基于HMGB1-RAGE信號通路研究奧拉米特預(yù)防抗結(jié)核藥物性肝損傷的作用機(jī)制

何玲 唐簡 彭忠田

中圖分類號 R978.3;R575;R965 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）18-2229-07

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.09

摘 要 目的：初步探討奧拉米特預(yù)防抗結(jié)核藥物性肝損傷（ATB-DILI）的可能機(jī)制。方法：將60只昆明小鼠隨機(jī)分為空白組、模型組、陽性對照組[甘草酸二銨60 mg/（kg·d）]和奧拉米特低、中、高劑量組[80、160、320 mg/（kg·d）]，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均灌胃異煙肼[75 mg/（kg·d）]+利福平[75 mg/（kg·d）]14 d以復(fù)制ATB-DILI模型。與此同時(shí)，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液，空白組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，給藥體積均為20 mL/（kg·d），每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。每天觀察并記錄小鼠生長發(fā)育、精神狀態(tài)、飲食等一般情況。末次給藥后，計(jì)算其肝指數(shù)，以蘇木精-伊紅（HE）染色法觀察小鼠肝組織病理學(xué)改變，采用鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）免疫組化法檢測其肝組織中高速泳動族蛋白B1（HMGB1）、核因子κB（NF-κB）的陽性表達(dá)情況，采用酶聯(lián)免疫吸附法檢測其血清中肝功能指標(biāo)水平和肝組織中晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（RAGE）、腫瘤壞死因子α（TNF-α）的表達(dá)情況。結(jié)果：與空白組比較，模型組小鼠生長發(fā)育遲緩，食欲、精神等差，肝指數(shù)和血清中總膽紅素、直接膽紅素、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶、天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶、堿性磷酸酶（ALP）、總膽汁酸（TBA）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶水平均顯著升高（P<0.05）;肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞變性、壞死，并伴炎癥細(xì)胞浸潤;肝組織中HMGB1、NF-κB、RAGE、TNF-α的表達(dá)均顯著增強(qiáng)（P<0.05）。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠的一般情況均有不同程度好轉(zhuǎn)，肝指數(shù)和上述血清指標(biāo)均顯著降低（P<0.05），肝組織病理學(xué)變化均有不同程度改善，肝組織中HMGB1、NF-κB、RAGE、TNF-α的表達(dá)均顯著降低（P<0.05），且奧拉米特高劑量組上述指標(biāo)改善效果均顯著優(yōu)于奧拉米特低、中劑量組（P<0.05），ALP、TBA水平顯著低于陽性對照組（P<0.05）。結(jié)論：奧拉米特能夠預(yù)防異煙肼聯(lián)合利福平所致的小鼠ATB-DILI，其機(jī)制可能與下調(diào)肝組織HMGB1和RAGE蛋白表達(dá)、抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

關(guān)鍵詞 奧拉米特;抗結(jié)核藥物性肝損傷;高速泳動族蛋白B1-晚期糖基化終末產(chǎn)物受體信號通路;小鼠

Study on the Prevention Mechanism of Anti-tuberculosis Drug-induced Liver Injury with Orazamide Based on HMGB1-RAGE Signaling Pathway

HE Ling，TANG Jian，PENG Zhongtian（Dept. of Infectious Diseases， the First Affiliated Hospital， Hengyang Medical School， University of South China， Hunan Hengyang 421001， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To preliminarily investigate the possible mechanism of orazamide to prevent anti-tuberculosis drug-induced liver injury （ATB-DILI）. METHODS： A total of 60 Kunming mice were randomly divided into blank group， model group， positive control group [diammonium glycyrrhizinate 60 mg/（kg·d）]， orazamide low-dose， medium-dose and high-dose groups [80， 160， 320 mg/（kg·d）]， with 10 mice in each group. Except for blank group， other groups were given isoniazid [75 mg/（kg·d）]+rifampicin [75 mg/（kg·d）] for 14 days intragastrically to induce ATB-DILI model. At the same time， administration groups were given relevant medicine intragastrically， blank group and model group were given normal saline intragastrically. The administration volume was 20 mL/（kg·d）， once a day， for consecutive 14 days. The general conditions of the mice were observed and recorded every day， such as growth and development， mental and diet state. After last medication， liver index was calculated， and HE staining was adopted to observe pathological changes of liver tissue of mice. The positive expression of high mobility group protein B1 （HMGB1） and NF-κB in liver tissue were detected by streptavidin biotin-peroxidase complex （SABC） immuno- histochemistry. The serum levels of liver function indexes in serum， the protein expression of advanced glycation end product receptor （RAGE） and TNF-α in liver tissue were detected by ELISA. RESULTS： Compared with blank group， the growth and development of mice in the model group were slow， and their appetite and spirit were poor. The liver index， serum levels of TBIL， DBIL， ALT， AST， ALP， TBA and γ-GT were increased significantly （P<0.05）. Structural disorder of liver lobules， degeneration and necrosis of liver cells and inflammatory cell infiltration were observed. The expression of HMGB1， NF-κB， RAGE and TNF-α in liver tissue were elevated significantly （P<0.05）. Compared with model group， the general condition of mice were all improved to different extents in orazamide low-dose， medium-dose and high-dose groups， positive control group， while liver index and above serum indexes were all decreased significantly （P<0.05）. The pathological changes of liver tissue were all improved to different extents， while the protein expression of HMGB1， NF-κB， RAGE and TNF-α were all decreased significantly （P<0.05）. The improvement of above indexes in orazamide high-dose group were all significantly better than orazamide low-dose and medium-dose groups （P<0.05）; the levels of ALP and TBA in orazamide high-dose group were significantly lower than positive control group （P<0.05）. CONCLUSIONS： Orazamide can prevent ATB-DILI induced by isoniazid combined with rifampicin in mice， the mechanism of which may be associated with down-regulating the protein expression of HMGB1 and RAGE in liver tissue and inhibiting the secretion of inflammatory factors.

KEYWORDS? ?Orazamide; Anti-tuberculosis drug-induced liver injury; HMGB1-RAGE signaling pathway; Mice

結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的一種多系統(tǒng)傳染病，也是人類患病和死亡的主要感染性原因，嚴(yán)重影響患者的生活質(zhì)量和生命安全，且近年來有抬頭趨勢，防控形勢十分嚴(yán)峻，是全球性的公共衛(wèi)生問題之一[1-2]。抗結(jié)核藥物性肝損傷（anti-tuberculosis drug-induced liver injury，ATB-DILI）是抗結(jié)核治療中最多見的且危害最大的不良反應(yīng)，其可致部分患者不得不中止抗結(jié)核治療，既降低了結(jié)核病治療的效果，又增加了耐藥結(jié)核病的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)[3]。目前，臨床一線護(hù)肝藥物的抗ATB-DILI機(jī)制研究有限，亟需尋找切實(shí)有效且機(jī)制明確的護(hù)肝藥物。

隨著分子生物學(xué)和免疫學(xué)研究在肝病領(lǐng)域的不斷深入，有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，高速泳動族蛋白B1（high mobility group box 1，HMGB1）與晚期糖基化終末產(chǎn)物受體（advanced glycation end product receptor，RAGE）可通過多種途徑來激活促炎因子的相互作用，從而介導(dǎo)肝組織損傷與炎癥級聯(lián)反應(yīng)的發(fā)生[4]。何雪等[5]研究表明，異煙肼聯(lián)合利福平所致肝細(xì)胞變性壞死與氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)密切相關(guān)，過氧化物酶體增殖物激活受體γ激動劑15d-PGJ2可能通過抗氧化及抑制HMGB1表達(dá)而發(fā)揮抗ATB-DILI的作用。鑒于HMGB1及RAGE在肝臟中的廣泛表達(dá)[6]，靶向HMGB1或RAGE在肝病治療中可能具有重要的應(yīng)用前景。奧拉米特（orazamide）又名阿卡明（aicamin），是一種臨床常用的護(hù)肝藥物，對ATB-DILI具有一定的預(yù)防作用[7]，但其護(hù)肝機(jī)制尚未明確。本研究通過異煙肼聯(lián)合利福平復(fù)制小鼠ATB-DILI模型，基于HMGB1-RAGE信號通路初步探討奧拉米特預(yù)防ATB-DILI的作用機(jī)制，以期為闡明奧拉米特預(yù)防ATB-DILI的機(jī)制提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括7170A型全自動生化分析儀（日本Hitachi公司），JY3002型電子天平（上海精密科學(xué)儀器有限公司），Motic B5型顯微攝像系統(tǒng)、Eco- Bino-LED型光學(xué)顯微鏡（麥克奧迪實(shí)業(yè)集團(tuán)有限公司），HBS-1101型酶標(biāo)儀（南京德鐵實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.2 主要藥品與試劑

奧拉米特片（批號20040185，規(guī)格0.1 g）購自湖南中南制藥有限責(zé)任公司;甘草酸二銨腸溶膠囊（陽性對照，批號191127110，規(guī)格50 mg）購自正大天晴藥業(yè)集團(tuán)股份有限公司;異煙肼片（批號1911009，規(guī)格0.1 g）購自天津力生制藥股份有限公司;利福平膠囊（批號191202，規(guī)格0.15 g）購自四川制藥制劑有限公司;總膽紅素（TBIL）、直接膽紅素（DBIL）、丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶（ALT）酶聯(lián)免疫吸附測定法（ELISA）檢測試劑盒（批號分別為20201212、20200512、20201112）均購自上?？迫A生物工程股份有限公司;天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶（AST）、堿性磷酸酶（ALP）、γ-谷氨酰轉(zhuǎn)肽酶（γ-GT）ELISA檢測試劑盒（批號分別為202012114、202101007、202101001）均購自溫州市維日康生物科技有限公司;總膽汁酸（TBA）ELISA檢測試劑盒（批號20-1118）購自北京九強(qiáng)生物技術(shù)股份有限公司;伊紅染料（批號20070321）購自天津市巴斯夫化工有限公司;蘇木精染料（批號68110020）購自北京蘭杰柯科技有限公司;RAGE、腫瘤壞死因子α（TNF-α）ELISA檢測試劑盒（批號分別為K11033093、M190905-102a）均購自欣博盛生物技術(shù)有限公司;鏈霉抗生物素蛋白-生物素-過氧化物酶復(fù)合物（SABC）試劑盒、3，3′-二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色試劑盒、兔HMGB1多克隆抗體試劑盒、兔核因子κB（NF-κB）多克隆抗體試劑盒（批號分別為K193314A、K193328E、OG11122356、AI07066414）均購自武漢博士德生物工程有限公司;其余試劑均為分析純，水為純化水。

1.3 實(shí)驗(yàn)動物

本研究所用實(shí)驗(yàn)動物為4周齡雄性SPF級昆明小鼠，共60只，體質(zhì)量為（20±2）g，實(shí)驗(yàn)動物生產(chǎn)許可證號為SCXK（湘）2016-0002，由湖南斯萊克景達(dá)實(shí)驗(yàn)動物有限公司提供。

2 方法

2.1 分組、造模與給藥

將60只小鼠按隨機(jī)數(shù)字表法分為空白組、模型組、陽性對照組[甘草酸二銨60 mg/（kg·d），以臨床常用劑量按體表面積比值法換算而得]和奧拉米特低、中、高劑量組[80、160、320 mg/（kg·d），以臨床常用劑量的1、2、4倍按體表面積比值法換算而得]，每組10只。除空白組外，其余各組小鼠均灌胃異煙肼[75 mg/（kg·d）]+利福平[75 mg/（kg·d）]14 d以復(fù)制ATB-DILI模型[8];與此同時(shí)，各給藥組小鼠灌胃相應(yīng)藥液（均以生理鹽水為溶劑），空白組和模型組小鼠灌胃生理鹽水，各組小鼠灌胃體積均為20 mL/（kg·d），造模和干預(yù)均每天給藥1次，連續(xù)給藥14 d。

2.2 小鼠一般情況觀察

每天觀察并記錄小鼠的生長發(fā)育、飲食、精神狀態(tài)、毛色改變、皮膚黏膜顏色、大小便及對外界刺激的反應(yīng)等，隔日稱定并記錄小鼠體質(zhì)量。

2.3 小鼠標(biāo)本采集與肝指數(shù)計(jì)算

末次給藥后，各組小鼠禁食、不禁水12 h，稱定體質(zhì)量后腹腔注射10%水合氯醛溶液（4 mL/kg）進(jìn)行麻醉，摘眼球取血適量，以3 000 r/min離心15 min，取上層血清，于4 ℃下保存，待測。隨后處死各組小鼠，取其完整肝臟并稱定肝濕質(zhì)量，計(jì)算肝指數(shù)（肝指數(shù)=肝濕質(zhì)量/小鼠體質(zhì)量×100%）。切取各組小鼠相同部位的肝組織，固定于4%多聚甲醛溶液中，用于蘇木精-伊紅（HE）染色及SABC免疫組化檢測;其余組織保存于-80 ℃冰箱中，用于ELISA檢測。

2.4 小鼠血清中肝功能指標(biāo)測定

取各組小鼠血清適量，采用ELISA法以全自動生化分析儀測定血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、ALP、γ-GT、TBA水平，具體操作按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.5 小鼠肝組織病理學(xué)檢查

取各組小鼠經(jīng)多聚甲醛固定后的肝組織，行常規(guī)脫水、石蠟包埋后切片（約3 μm），以HE染色并置于光學(xué)顯微鏡下觀察肝組織病理學(xué)變化情況。

2.6 小鼠肝組織中HMGB1、NF-κB蛋白表達(dá)測定

采用SABC免疫組化法進(jìn)行測定。取各組小鼠經(jīng)多聚甲醛固定后的肝組織，按SABC試劑盒說明書進(jìn)行操作，以DAB顯色后，置于光學(xué)顯微鏡下觀察（陽性表達(dá)的細(xì)胞為棕色或棕褐色）。每張切片隨機(jī)選取5個(gè)不連續(xù)視野，用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算單位測量區(qū)域面積內(nèi)的光密度值，用于評價(jià)陽性表達(dá)率。

2.7 小鼠肝組織中RAGE、TNF-α蛋白表達(dá)測定

取各組小鼠解凍后的肝組織200 mg，制備肝組織勻漿，按ELISA法以酶標(biāo)儀測定肝組織中RAGE、TNF-α蛋白的表達(dá)水平，具體操作按相應(yīng)試劑盒說明書進(jìn)行。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

采用SPSS 20.0軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，若數(shù)據(jù)同時(shí)滿足正態(tài)分布及方差齊性檢驗(yàn)則多組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗(yàn);若不滿足上述條件則采用Kruskal-Wallis H秩和檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 小鼠一般情況及肝濕質(zhì)量、肝指數(shù)

空白組小鼠生長發(fā)育正常，食欲、精神佳，毛發(fā)濃密、色澤可，皮膚及大小便未見異常，應(yīng)激反應(yīng)強(qiáng)烈。與空白組比較，模型組小鼠生長發(fā)育遲緩，食欲、精神差，毛發(fā)稀疏、色澤晦暗，腳掌、大小便呈橘紅色，便稀，應(yīng)激反應(yīng)遲鈍。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠上述情況可見不同程度好轉(zhuǎn)，食欲、精神改善，腳掌、大小便顏色變淺。

末次給藥后，各組小鼠的體質(zhì)量比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。與空白組比較，模型組小鼠的肝濕質(zhì)量及肝指數(shù)均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠的肝濕質(zhì)量及肝指數(shù)均顯著降低（P<0.05），但組間比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表1。

3.2 小鼠血清中肝功能指標(biāo)

與空白組比較，模型組小鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、ALP、γ-GT、TBA水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、ALP、γ-GT、TBA水平均顯著降低（P<0.05），且奧拉米特高劑量組上述指標(biāo)水平均顯著低于奧拉米特低、中劑量組（P<0.05），ALP、TBA水平均顯著低于陽性對照組（P<0.05）。奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠血清中上述指標(biāo)水平均未恢復(fù)至空白組水平，詳見表2。

3.3 小鼠肝組織病理學(xué)變化情況

空白組小鼠可見肝小葉結(jié)構(gòu)清晰，肝索排列整齊，肝血竇結(jié)構(gòu)完整，肝細(xì)胞核大而圓，居中，未見炎癥細(xì)胞浸潤。模型組小鼠肝索排列紊亂，肝竇結(jié)構(gòu)不清，肝細(xì)胞體積增大，有氣球樣變，胞質(zhì)疏松，并出現(xiàn)不同程度壞死，胞核被推向一側(cè)，伴明顯的炎癥細(xì)胞浸潤。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝小葉及肝細(xì)胞結(jié)構(gòu)均有不同程度改善，且以奧拉米特高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織結(jié)構(gòu)與空白組最為接近，詳見圖1（圖中箭頭表示炎癥細(xì)胞）。

3.4 小鼠肝組織中HMGB1和NF-κB蛋白的表達(dá)水平

鏡下，HMGB1和NF-κB蛋白在胞核和胞質(zhì)中均有表達(dá)。與空白組比較，模型組小鼠肝組織中HMGB1和NF-κB蛋白均呈強(qiáng)陽性表達(dá)。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織中HMGB1和NF-κB蛋白表達(dá)均出現(xiàn)不同程度降低，但均未降至空白組水平，詳見圖2、圖3。

與空白組比較，模型組小鼠肝組織中HMGB1和NF-κB蛋白的陽性表達(dá)率均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織中HMGB1和NF-κB蛋白的陽性表達(dá)率均顯著降低（P<0.05），且奧拉米特高劑量組上述蛋白的陽性表達(dá)率均顯著低于奧拉米特低、中劑量組（P<0.05），而與陽性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。僅奧拉米特高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織中HMGB1蛋白的陽性表達(dá)率與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表3。

3.5 小鼠肝組織中RAGE和TNF-α蛋白的表達(dá)水平

與空白組比較，模型組小鼠肝組織中RAGE和TNF-α蛋白的表達(dá)水平均顯著升高（P<0.05）。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織中RAGE和TNF-α蛋白的表達(dá)水平均顯著降低（P<0.05），且奧拉米特高劑量組上述蛋白的表達(dá)水平均顯著低于奧拉米特低、中劑量組（P<0.05），而與陽性對照組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。僅奧拉米特高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織中RAGE蛋白的表達(dá)水平與空白組比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05），詳見表4。

4 討論

據(jù)估算，全球每天約有5 000人死于結(jié)核病[9]。結(jié)核病作為危害全球人類健康的重大公共衛(wèi)生問題之一，不得不引起人們的高度關(guān)注及重視。異煙肼和利福平均是一線抗結(jié)核藥物，且臨床常聯(lián)合使用，兩藥單用時(shí)均有致肝損傷的副作用，聯(lián)用后肝臟毒性加重[10]。李詩瑩等[11]認(rèn)為，氧化應(yīng)激和線粒體功能障礙可能在異煙肼誘導(dǎo)ATB-DILI中發(fā)揮了重要作用。張一楊等[12]發(fā)現(xiàn)，異煙肼誘導(dǎo)肝細(xì)胞損傷可能與低表達(dá)沉默信息調(diào)節(jié)因子1增加NF-κB p65、白細(xì)胞介素6、TNF-α等炎癥因子的釋放相關(guān)。李津等[13]研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)異煙肼和利福平兩藥聯(lián)用時(shí)，利福平的肝微粒體酶誘導(dǎo)作用可增強(qiáng)異煙肼降解產(chǎn)物乙酰肼的肝毒性。向曉雪等[14]實(shí)驗(yàn)表明，兩藥聯(lián)用時(shí)肝毒性主要來源于利福平所致的膽汁淤積。為此，本研究利用異煙肼聯(lián)合利福平復(fù)制ATB-DILI模型，結(jié)果顯示，與空白組比較，模型組小鼠血清中TBIL、DBIL、ALT、AST、ALP、γ-GT、TBA水平均顯著升高，并伴有肝小葉結(jié)構(gòu)紊亂，肝細(xì)胞變性、壞死，炎癥細(xì)胞浸潤等病理改變，與本課題組前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果基本一致，提示ATB-DILI模型復(fù)制成功。

奧拉米特為嘌呤及嘧啶衍生物前體，有阻止肝細(xì)胞壞死和肝纖維化的作用，并能刺激肝細(xì)胞再生，活化肝實(shí)質(zhì)細(xì)胞，在改善急慢性肝損傷及調(diào)節(jié)代謝異常方面有著十分肯定的作用[7，15]，且對ATB-DILI也有一定的預(yù)防效果[6]，但其護(hù)肝機(jī)制尚未明確。近期研究表明，經(jīng)具有抗氧化特性的HMGB1抑制劑甘草酸預(yù)處理或處理后，缺血再灌注肝損傷模型小鼠的肝臟炎癥、中性粒細(xì)胞浸潤和乙酰氨基酚所致的損傷均明顯減輕[16-17]。為深入認(rèn)識奧拉米特在ATB-DILI中的作用機(jī)制，從而提供早期防治的新思路，本研究按照臨床成人劑量的1、2、4倍設(shè)置奧拉米特低、中、高劑量組，以臨床常用護(hù)肝藥物甘草酸制劑（甘草酸二銨腸溶膠囊）為對照藥物設(shè)置陽性對照組。結(jié)果顯示，低、中、高劑量奧拉米特和甘草酸二銨均可以顯著降低ATB-DILI模型小鼠的肝指數(shù)，改善其肝功能指標(biāo)，減輕其肝細(xì)胞損傷和炎癥細(xì)胞浸潤。這說明奧拉米特能夠預(yù)防ATB-DILI。

HMGB1是一種廣泛存在于真核細(xì)胞核內(nèi)且含量極豐富的DNA結(jié)合蛋白，在核內(nèi)參與DNA復(fù)制、重塑和DNA修復(fù)等過程，當(dāng)細(xì)胞應(yīng)激或死亡時(shí)，其可以遷移到細(xì)胞質(zhì)中或釋放至細(xì)胞外。近年來，HMGB1作為一種常見的損傷相關(guān)模式分子，發(fā)揮著啟動和促進(jìn)炎癥反應(yīng)、加重組織損傷的作用[18]。有研究發(fā)現(xiàn)，在ALT或國際標(biāo)準(zhǔn)化比值（INR）正常的患者中，臨床可通過HMGB1早期識別進(jìn)展性肝損傷，該蛋白作為未來的一種新型生物標(biāo)志物具有較高的預(yù)測效能[19-20]。RAGE是最早發(fā)現(xiàn)的且高親和的HMGB1受體，兩者結(jié)合后可以通過NF-κB抑制蛋白、p38絲裂原活化蛋白激酶等炎癥信號通路活化NF-κB，NF-κB激活后可誘導(dǎo)并促進(jìn)TNF-α、白細(xì)胞介素1β等多種炎癥因子的表達(dá)，而這些炎癥因子又可作為激動劑再反向作用于NF-κB，從而形成了NF-κB正反饋環(huán)，放大炎癥級聯(lián)反應(yīng)，形成炎癥瀑布效應(yīng)，從而形成持續(xù)的、擴(kuò)大的、強(qiáng)化的炎癥免疫反應(yīng)，加重機(jī)體組織的損傷[21-22]。當(dāng)機(jī)體細(xì)胞處于穩(wěn)態(tài)時(shí)，HMGB1主要存在于細(xì)胞核，而NF-κB存在于細(xì)胞質(zhì)中;當(dāng)遇到外界刺激時(shí)，兩者表達(dá)上調(diào)并出現(xiàn)“轉(zhuǎn)位”現(xiàn)象[22]。本研究SABC免疫組化結(jié)果顯示，空白組小鼠肝細(xì)胞內(nèi)HMGB1和NF-κB呈微量表達(dá)，模型組小鼠肝細(xì)胞胞核和胞質(zhì)中HMGB1和NF-κB的表達(dá)均明顯增強(qiáng)，說明機(jī)體處于炎癥反應(yīng)狀態(tài)。與模型組比較，奧拉米特低、中、高劑量組和陽性對照組小鼠肝組織中HMGB1、RAGE、NF-κB、TNF-α蛋白的表達(dá)均顯著降低，提示奧拉米特對異煙肼聯(lián)合利福平所致ATB-DILI有預(yù)防作用，其機(jī)制可能與下調(diào)肝組織中HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)、抑制炎癥因子的分泌有關(guān)，可能與陽性對照藥物的作用機(jī)制相同。此外，本研究還發(fā)現(xiàn)奧拉米特高劑量組小鼠肝組織中HMGB1和RAGE蛋白的表達(dá)水平恢復(fù)至空白組水平，但NF-κB和TNF-α蛋白的表達(dá)水平未達(dá)到空白組水平，說明可能存在其他炎癥通路激活NF-κB介導(dǎo)的下游級聯(lián)炎癥反應(yīng)，具體原因有待進(jìn)一步探討。

綜上所述，奧拉米特能夠預(yù)防異煙肼聯(lián)合利福平所致的小鼠ATB-DILI，其機(jī)制可能與下調(diào)肝組織中HMGB1和RAGE蛋白表達(dá)、抑制炎癥因子分泌有關(guān)。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 徐彩紅，趙雁林.從《2020年全球結(jié)核病報(bào)告》看我國結(jié)核病防治工作[J].中華傳染病雜志，2021，39（7）：392- 397.

[ 2 ] 甄瑞霞.抗結(jié)核病藥物的研究進(jìn)展[J].中國城鄉(xiāng)企業(yè)衛(wèi)生，2021，36（7）：25-27.

[ 3 ] 中華醫(yī)學(xué)會結(jié)核病學(xué)分會.抗結(jié)核藥物性肝損傷診治指南：2019年版[J].中華結(jié)核和呼吸雜志，2019，42（5）：343-356.

[ 4 ] ARRIAZU E，GE X，LEUNG T M，et al. Signalling via the osteopontin and high mobility group box-1 axis drives the fibrogenic response to liver injury[J]. Gut，2017，66（6）：1123-1137.

[ 5 ] 何雪，宋育林，王莉，等.激活PPARγ抑制異煙肼與利福平合用致大鼠肝損傷及HMGB1水平上調(diào)[J].中國組織化學(xué)與細(xì)胞化學(xué)雜志，2017，26（2）：129-133.

[ 6 ] GASKELL H，GE X D，NIETO N. High-mobility group box-1 and liver disease[J]. Hepatol Commun，2018，2（9）：1005-1020.

[ 7 ] 林忠惠，李學(xué)玲，陳芬，等.奧拉米特在抗結(jié)核治療中的護(hù)肝作用研究[J].實(shí)用心腦肺血管病雜志，2013，21（7）：85-86.

[ 8 ] 楊淑艷，鐘秀宏，王爽，等.異煙肼和利福平聯(lián)用致小鼠肝損傷實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ偷慕J].中國藥房，2011，22（33）：3104-3105.

[ 9 ] 高丹丹.抗結(jié)核藥物的研究進(jìn)展[J].齊齊哈爾醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào)，2020，41（7）：882-885.

[10] 王新華，何紅梅，張延霞，等.利福霉素鈉與異煙肼合用對小鼠肝臟毒性的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國藥房，2007，18（25）：1935-1937.

[11] 李詩瑩，黃衛(wèi)鋒，胡秋慧.藥物性肝損傷與Nrf2信號通路之關(guān)系的研究[J/OL]. 中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2021：1-7[2021-

01-26]. http：//kns.cnki.net/kcms/detail/43.1225.r.20210115.

0934.002.html.

[12] 張一楊，李瑩淑，李金鳳，等. SIRT1通過降低NF-κB p65表達(dá)減輕異煙肼致人肝細(xì)胞損傷的研究[J].中國現(xiàn)代醫(yī)學(xué)雜志，2018，28（22）：7-12.

[13] 李津，林文鋒，潘燕玉，等.水飛薊賓對抗結(jié)核藥物所致肝功能損害的保護(hù)作用[J].中華肝臟病雜志，2010，18（5）：385-386.

[14] 向曉雪，艾佳晨，趙科，等.利福平和異煙肼致小鼠肝損傷模型的特征研究[J].中國藥理學(xué)通報(bào)，2019，35（4）：586-590.

[15] 湖南醫(yī)藥工業(yè)研究所三室301組.抗肝炎藥阿卡明的合成[J].醫(yī)藥工業(yè)，1974（4）：4-7.

[16] HUEBENER P，PRADERE J P，HERNANDEZ C，et al.The HMGB1/RAGE axis triggers neutrophil-mediated injury amplification following necrosis[J]. J Clin Invest，2015，125（2）：539-550.

[17] WANG X，SUN R，WEI H，et al. High-mobility group box 1（HMGB1）-toll-like receptor（TLR）4-interleukin（IL）- 23-IL-17A interaction of γδT cells with macrophages[J]. Hepatology，2013，57（1）：373-384.

[18] 劉貴軍，李全，于雷.富硒姬松茸對小鼠急性酒精性肝炎的保護(hù)作用及其機(jī)制[J].中醫(yī)藥信息，2016，33（5）：15-19.

[19] DANIEL J A，ROSALIND E J，JAMES W D，et al. Mole- cular forms of HMGB1 and keratin-18 as mechanistic biomarkers for mode of cell death and prognosis during clinical acetaminophen hepatotoxicity[J]. J Hepatol，2012，56（5）：1070-1079.

[20] DANIEL J A，JAMES W D，PHILIP S L，et al. Mechanistic biomarkers provide early and sensitive detection of ace- taminophen-induced acute liver injury at first presentation to hospital[J]. Hepatology，2013，58（2）：777-787.

[21] DE LUCCA F，WATANABE M，SERRANO S，et al. Activation of RNA-dependent protein kinase and nuclear factor-κB by regulatory RNA from lipopolysaccharide-stimulated macrophages：implications for cytokine production[J]. Eur J Pharmacol，2002，450（1）：85-89.

[22] 李曉理. HMGB1-RAGE信號通路在利福平誘導(dǎo)的小鼠肝損傷模型中的作用及其可能機(jī)制的研究[D].合肥：安徽醫(yī)科大學(xué)，2018.

（收稿日期：2021-04-14 修回日期：2021-08-08）

（編輯：鄒麗娟）