UPLC-MS/MS法測定人血漿中20（S）-原人參二醇的濃度

劉勝蘭 唐智 陳磊 吳素芬 周玲 廖音娟 張杰

中圖分類號 R917;R593.22 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號 1001-0408（2021）18-2248-06

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.18.12

摘 要 目的：建立測定人血漿中20（S）-原人參二醇（簡稱為“PPD”）濃度的方法。方法：血漿樣品經(jīng)乙腈沉淀蛋白后，以非那雄胺為內(nèi)標(biāo)，采用超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定。色譜柱為Waters ACQUITY UPLC HSS T3，流動相為5 mmol/L碳酸氫銨溶液-乙腈（梯度洗脫），流速為0.4 mL/min，柱溫為40 ℃，進(jìn)樣量為10 μL;離子源為電噴霧離子源，以多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行負(fù)離子掃描，用于定量分析的離子對分別為m/z 459.40→375.20（PPD）、m/z 371.30→315.30（內(nèi)標(biāo)）。同時將該法用于臨床樣品的測定。結(jié)果：PPD檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.25～30.00 ng/mL（r=0.999 2），定量下限為0.25 ng/mL;批內(nèi)、批間RSD均小于10%，相對誤差（RE）為-14.61%～12.69%;提取方法和基質(zhì)效應(yīng)均不影響PPD的定量測定。人參皂苷CK片100 mg組、人參皂苷CK片200 mg組、人參皂苷CK片300 mg組類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎患者口服相應(yīng)藥物第84天時的平均cmax分別為18.06、30.03、27.00 ng/mL，中位tmax分別為12.0、6.0、12.0 h，平均AUC0-t分別為622.52、668.15、1 155.97 ng·h/mL。結(jié)論：本研究成功建立了測定人血漿中PPD濃度的方法，且方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，操作簡便，血漿用量少，可用于臨床樣本的定量測定。

關(guān)鍵詞 20（S）-原人參二醇;超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法;蛋白沉淀法;血藥濃度

Determination of 20（S）-protopanaxadiol Concentration in Human Plasma by UPLC-MS/MS

LIU Shenglan1，TANG Zhi2，CHEN Lei3，WU Sufen3，ZHOU Ling2，LIAO Yinjuan1，ZHANG Jie4（1. Dept. of Pharmacy， Changsha Hospital of Hunan Normal University/the Fourth Hospital of Changsha， Changsha? 410006， China; 2. Hunan Key Laboratory for Bioanalysis of Complex Matrix Samples， Changsha Duxact Biotech Co.， Ltd.， Changsha 410205， China;? 3. Central Research Institute， Zhejiang Hisun Pharmaceutical Co.， Ltd.， Zhejiang Taizhou 318000， China; 4. Dept. of Pharmacy， the Third Xiangya Hospital of Central South University， Changsha 410013， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To establish the method for the determination of 20（S）-protopanaxadiol （PPD） concentration in human plasma. METHODS： Plasma samples were precipitated with acetonitrile and determined by UPLC-MS/MS， using finandrogen as internal standard. The determination was performed on Waters ACQUITY UPLC HSS T3 column with mobile phase consisted of 5 mmol/L ammonium bicarbonate aqueous solution-acetonitrile （gradient elution） at the flow rate of 0.4 mL/min. The column temperature was set at 40 ℃， and sample size was 10 μL. The ion source was electrospray ion source， and negative ion scanning was carried out with multiple reaction monitoring mode. The ion pairs used for quantitative analysis were m/z 459.40→375.20 （PPD） and m/z 371.30→315.30 （internal standard）. At the same time， the method was applied to the determination of clinical samples. RESULTS： The linear range of PPD was 0.25-30.00 ng/mL （r=0.999 2）， and the limit of quantitation was 0.25 ng/mL. RSDs of intra-batch and inter-batch were all lower than 10%， and relative errors （RE） were -14.61%-12.69%. Extraction method and matrix effect did not affect the quantitative determination of PPD. In ginsenoside CK 100 mg group， ginsenoside CK 200 mg group and ginsenoside CK 300 mg group， mean cmax of patients with rheumatoid arthritis after oral administration of corresponding drugs were 18.06， 30.03， 27.00 ng/mL; median tmax were 12.0， 6.0， 12.0 h; mean AUC0-t were 622.52， 668.15，? ? ?1 155.97 ng·h/mL. CONCLUTIONS： The method for the determination of PPD concentration in human plasma is successfully established. The method is sensitive， accurate， stable， easy to operate and less plasma consumption. It can be used for the quantitative determination of clinical samples.

KEYWORDS? ?20（S）-protopanaxadiol; UPLC-MS/MS; Protein

precipitation method; Plasma concentration

20（S）-原人參二醇[20（S）-PPD，以下簡稱“PPD”]為二醇型人參皂苷的苷元，是稀有人參二醇皂苷Rd、F2、Rg3、CK、Rh2的主要活性代謝產(chǎn)物[1]，具有抗癌、抗抑郁、止血、激活氯離子通道和抑制鈉離子通道去極化等諸多藥理活性[2-5]。有報道稱，人參皂苷CK在體內(nèi)和體外均可被胃酸和/或腸道微生物進(jìn)一步分解并轉(zhuǎn)化為PPD，且PPD為二醇型人參皂苷活性最強(qiáng)的代謝產(chǎn)物[6]。對于人參皂苷CK等二醇型人參皂苷的臨床藥動學(xué)研究而言，準(zhǔn)確、快速測定生物樣品中PPD的濃度極為重要。

雖然，目前已有報道采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（LC-MS/MS）檢測血漿中PPD的濃度，但大多數(shù)文獻(xiàn)的前處理方法復(fù)雜，如液液萃取法[7-12]、固相萃取法[13]、柱前衍生化法[14]、基于C8-修飾內(nèi)孔壁的磁性核-介孔殼微球制備法[15]等;也有文獻(xiàn)采用蛋白沉淀法進(jìn)行前處理，但其定量下限過高，且方法學(xué)驗證不夠全面[16-17]。隨著臨床試驗倫理審核要求以及生物分析法規(guī)的不斷提高和完善，文獻(xiàn)報道的方法已經(jīng)很難滿足臨床試驗批量樣品檢測和現(xiàn)階段法規(guī)的要求[18]。基于此，本研究采用蛋白沉淀法對血漿樣品進(jìn)行前處理，再結(jié)合超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法（UPLC-MS/MS）測定人血漿中PPD的質(zhì)量濃度，并成功將此法應(yīng)用于人參皂苷CK片的臨床ⅠB期研究，現(xiàn)報道如下。

1 材料

1.1 主要儀器

本研究所用主要儀器包括ACQUITY UPLC Ⅰ-Class型超高效液相色譜（UPLC）儀（美國Waters公司），AB Sciex 6500+型三重四極桿質(zhì)譜儀及配備的電噴霧離子源（ESI）、Analyst 1.6.3數(shù)據(jù)處理軟件（美國Applied Biosystem公司），MSA6.6S.CE型百萬分之一電子天平（德國Sartorius公司），MilliQ Direct 8型超純水儀（美國Millipore公司），ST16R型離心機(jī)（美國Thermo Fisher Scientific公司），Talboys型數(shù)顯多管式渦旋振蕩器（美國Troemner公司）等。

1.2 主要藥品和試劑

人參皂苷CK片（規(guī)格50 mg）由浙江海正藥業(yè)股份有限公司提供;PPD對照品（批號111747-201602，純度96.6%）、非那雄胺對照品（內(nèi)標(biāo)，批號100611-201302，純度99.6%）均購自中國食品藥品檢定研究院;甲醇（色譜純）、乙腈（色譜純）均購自德國Merck公司;碳酸氫銨（分析純）購自天津科密歐化學(xué)試劑有限公司;其余試劑均為實(shí)驗室常用規(guī)格或分析純，水為超純水。

1.3 空白血漿

人空白血漿和空白全血均從健康受試者中采集（倫理批件號快LS2017120502），溶血血漿采用空白血漿+空白全血配制而成（全血體積占比為2%），高脂血漿采用空白血漿+三酰甘油配制而成（三酰甘油含量≥3 mg/mL）。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件

以Waters ACQUITY UPLC HSS T3（2.1 mm×50 mm，1.8 ?m）為色譜柱，以5 mmol/L碳酸氫銨溶液（A）-乙腈（B）為流動相進(jìn)行梯度洗脫（0～0.5 min，60%A;0.5～2.5 min，60%A→15%A;2.5～3 min，15%A，3～4 min，15%A→60%A）;流速為0.4 mL/min;柱溫為40 ℃;自動進(jìn)樣器溫度為10 ℃;進(jìn)樣量為10 μL。

2.2 質(zhì)譜條件

離子源為ESI，以多反應(yīng)監(jiān)測模式（MRM）進(jìn)行負(fù)離子掃描，具體質(zhì)譜參數(shù)見表1。

2.3 溶液制備

2.3.1 PPD標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)控溶液 稱取PPD對照品適量，用50%乙腈溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度為0.500 mg/mL的貯備液。取該貯備液適量，用50%乙腈稀釋，制成質(zhì)量濃度分別為600、480、240、120、60、30、10、5 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)溶液和質(zhì)量濃度分別為450、90、15、5 ng/mL的質(zhì)控溶液。

2.3.2 內(nèi)標(biāo)工作液 稱取內(nèi)標(biāo)對照品適量，用50%乙腈溶解并稀釋，制成質(zhì)量濃度為0.200 mg/mL的貯備液。取該貯備液適量，用乙腈（沉淀劑）稀釋，制成質(zhì)量濃度為10 ng/mL的內(nèi)標(biāo)工作液。

2.4 血漿樣品前處理

取血漿樣品200 ?L，加入內(nèi)標(biāo)工作液（空白樣品以乙腈替代）600 ?L，振蕩30 s，以13 500 r/min離心8 min，取上清液進(jìn)樣分析。

2.5 專屬性考察

取6份不同來源的空白血漿，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣分析，得圖1A;另取不同來源的空白血漿各190 ?L，精密加入PPD標(biāo)準(zhǔn)溶液（5 ng/mL）10 ?L，渦旋混勻，按“2.4”項下方法處理后，進(jìn)樣分析，得圖1B。另取受試血漿（給藥后24 h采集）適量，按“2.4”項下方法處理后，進(jìn)樣分析，得圖1C。由圖1可見，PPD和內(nèi)標(biāo)的分離度良好，內(nèi)源性物質(zhì)對其定量分析無干擾，表明本方法專屬性良好。

2.6 線性范圍與定量下限考察

取空白血漿190 μL，精密加入“2.3.1”項下PPD系列標(biāo)準(zhǔn)溶液各10 ?L，渦旋混勻，制成PPD質(zhì)量濃度分別為0.25、0.50、1.50、3.00、6.00、12.00、24.00、30.00 ng/mL的系列標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以PPD質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（x，ng/mL）、PPD與內(nèi)標(biāo)的峰面積比值為縱坐標(biāo)（y）進(jìn)行線性回歸，得回歸方程為y=0.241 0x+0.016 6（r=0.999 2）。結(jié)果顯示，PPD檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為0.25～30.00 ng/mL，定量下限為0.25 ng/mL。

2.7 精密度與準(zhǔn)確度考察

取“2.3.1”項下PPD質(zhì)控溶液，按“2.6”項下方法制成定量下限質(zhì)量濃度（0.25 ng/mL）和低、中、高質(zhì)量濃度（0.75、4.50、22.50 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。每個分析批平行操作6個樣品、連續(xù)操作3個分析批，分別根據(jù)隨行批標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各質(zhì)控血漿樣品中待測物的實(shí)測質(zhì)量濃度，計算批內(nèi)、批間精密度[以相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）表示]和準(zhǔn)確度[以相對誤差（RE）表示]。結(jié)果顯示，各樣品批內(nèi)、批間RSD均小于10%，RE為-14.61%～12.69%，詳見表2。

2.8 提取回收率與基質(zhì)效應(yīng)考察

按“2.6”項下方法配制PPD低、中、高質(zhì)量濃度（0.75、4.50、22.50 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品各6份，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積（A）。將不同來源的空白血漿、溶血血漿、高脂血漿按“2.4”項下方法處理后，加入相應(yīng)質(zhì)量濃度的PPD標(biāo)準(zhǔn)溶液，使最終質(zhì)量濃度與前者對應(yīng)，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積（B）。分別用50%乙腈配制含內(nèi)標(biāo)且質(zhì)量濃度與前者對應(yīng)的PPD標(biāo)準(zhǔn)溶液，按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積（C）。按下式計算提取回收率和基質(zhì)效應(yīng)：提取回收率（%）=A/B×100%，基質(zhì)效應(yīng)=B/C。結(jié)果顯示，PPD和內(nèi)標(biāo)的提取回收率為（98.43±6.39）%～（103.90±0.89）%，RSD均小于10%;PPD和內(nèi)標(biāo)在空白血漿、溶血血漿、高脂血漿中的基質(zhì)效應(yīng)分別為（0.87±0.03）～（1.07±0.06）、（0.88±0.03）～（0.99±0.14）、（0.92±0.06）～（1.12±0.09），RSD均小于10%，詳見表3。

2.9 穩(wěn)定性試驗

按“2.6”項下方法配制PPD低、高質(zhì)量濃度（0.75、22.50 ng/mL）的質(zhì)控血漿樣品各6份，考察其處理前在室溫下放置24 h、反復(fù)凍融（-70 ℃～室溫）4次、 -20 ℃下凍存13 d、-70 ℃下長期凍存192 d的穩(wěn)定性，處理后在進(jìn)樣器條件（10 ℃）下放置27 h的穩(wěn)定性，處理后在進(jìn)樣條件（10 ℃）下放置24 h再進(jìn)樣的穩(wěn)定性，全血樣品（用空白全血配制的含PPD的全血樣品）處理前在室溫下放置2 h的穩(wěn)定性，PPD貯備液在室溫下放置33 h、4 ℃下放置66 d的穩(wěn)定性，PPD標(biāo)準(zhǔn)溶液在室溫下放置33 h、4 ℃下放置8 d的穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，在上述條件下，各樣品實(shí)測質(zhì)量濃度與理論質(zhì)量濃度的RE均在±10%以內(nèi)，表明PPD在樣品采集、運(yùn)輸、儲存及分析過程所涉及的各個環(huán)節(jié)中均具有良好的穩(wěn)定性。

2.10 稀釋可靠性考察

按“2.6”項下方法配制PPD質(zhì)量濃度為60 ng/mL的標(biāo)準(zhǔn)血漿樣品，用空白血漿稀釋5倍，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。按此稀釋倍數(shù)平行操作6份，以考察稀釋是否會對待測物的定量分析造成影響。結(jié)果顯示，實(shí)測質(zhì)量與理論質(zhì)量濃度的RE為0.01%，實(shí)測質(zhì)量濃度的RSD為3.98%（n=6），提示血漿樣品經(jīng)空白血漿稀釋5倍不會影響其定量分析。

2.11 分析批長度考察

按“2.6”項下方法配制線性范圍內(nèi)且含PPD及內(nèi)標(biāo)的血漿樣品，均勻穿插在質(zhì)控血漿樣品之間進(jìn)樣測定，可重復(fù)進(jìn)樣，考察分析批長度。結(jié)果顯示，該分析批至少可以連續(xù)進(jìn)樣160個樣品，其質(zhì)控血漿樣品的實(shí)測質(zhì)量濃度均在理論質(zhì)量濃度的±15%之內(nèi)。

2.12 測定方法的應(yīng)用

2.12.1 給藥方案與血樣采集 在一項多中心、隨機(jī)、雙盲、多劑量、平行的人參皂苷CK片用于類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎（RA）患者安全性、藥動學(xué)和初步療效的ⅠB期臨床研究試驗（倫理批準(zhǔn)號2013L01910）中，共有受試者3組：人參皂苷CK片100 mg組（6例）、人參皂苷CK片200 mg組（5例）、人參皂苷CK片300 mg組（5例）。各組受試者均于每天早餐后2 h給藥1次，連續(xù)給藥84 d。每例參加藥動學(xué)試驗的受試者除篩選前（基線）及各次隨訪給藥前（0、2、4、8、12周）采血5 mL用于血藥濃度測定外，還均分別于第1天服藥前30 min及服藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24 h采血5 mL以及于末次服藥前30 min及服藥后0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、12、24、48、72、96 h采血5 mL用于血藥濃度測定。使用含乙二胺四乙酸二鉀（EDTA-K2）抗凝劑的真空采血管采集血樣，于4 ℃下以3 000 r/min離心10 min，分離血漿，-70 ℃保存，待測。

2.12.2 樣品測定及數(shù)據(jù)分析 取3個劑量組受試者各采血點(diǎn)的血漿樣品，稀釋至線性范圍內(nèi)，按“2.4”項下方法處理后，再按“2.1”“2.2”項下條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。使用AB Analyst 1.6.3軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行采集和定量分析，通過隨行標(biāo)準(zhǔn)曲線計算各待測樣品中PPD的質(zhì)量濃度，得到3個劑量組受試者給藥第1天和給藥第84天PPD的平均藥-時曲線，見圖2（圖中小圖為局部放大圖）;采用Phoenix WinNolin 7.0藥動學(xué)軟件中的非房室模型計算3個劑量組受試者的藥動學(xué)參數(shù)，原始數(shù)據(jù)取自然對數(shù)后再進(jìn)行比較，結(jié)果見表4（由于本研究納入的樣本例數(shù)較少，導(dǎo)致數(shù)據(jù)離散程度較大，從而導(dǎo)致部分?jǐn)?shù)據(jù)的標(biāo)準(zhǔn)差大于均值）。

3 討論

3.1 流動相的選擇

PPD采用負(fù)離子模式檢測，一般情況下，堿性流動相有利于其離子化，但堿性條件不利于化合物與基質(zhì)中的酸性物質(zhì)分離，容易出現(xiàn)明顯的基質(zhì)效應(yīng)。所以在方法建立的過程中，本課題組分別對酸性流動相、堿性流動相進(jìn)行了考察。結(jié)果顯示，在酸性流動相條件下，PPD的檢測受基質(zhì)影響較小，但響應(yīng)也明顯減弱，定量下限無法滿足檢測要求;在堿性流動相條件下，所得色譜峰的響應(yīng)較強(qiáng)，噪音明顯弱于酸性流動相，并且基質(zhì)效應(yīng)滿足檢測要求。另外，在堿性流動相的選擇中，本課題組還分別考察了氨水和碳酸氫銨作為pH調(diào)節(jié)劑的效果。結(jié)果顯示，當(dāng)用氨水作為pH調(diào)節(jié)劑時，隨著分析批進(jìn)樣數(shù)量的增加、進(jìn)樣時間的延長，PPD的出峰時間和響應(yīng)均不穩(wěn)定，其原因可能是流動相中氨水揮發(fā)，導(dǎo)致流動相的pH發(fā)生改變所致;而用碳酸氫銨作為pH調(diào)節(jié)劑時，因為其是緩沖鹽，在室溫條件下基本不會揮發(fā)，使得流動相的pH相對穩(wěn)定，所以本方法最終選擇5 mmol/L碳酸氫銨溶液作為水相。碳酸氫銨于濕度25%～75%的室溫下保存，使用期限為2 d。

3.2 前處理方法的選擇

在方法建立階段，本課題組參考文獻(xiàn)[7-12]采用液液萃取法進(jìn)行樣品前處理，但發(fā)現(xiàn)該方法提取回收率不高、處理步驟繁瑣，而且血漿用量較大。由于本研究涉及臨床Ⅰ期試驗，臨床樣品量較大且后期試驗周期較長，故有必要探索蛋白沉淀法作為樣品前處理的可行性。結(jié)合液相條件優(yōu)化、內(nèi)標(biāo)選擇，本課題組發(fā)現(xiàn)，采用乙腈沉淀可以滿足本研究大樣本檢測的要求，同時具有處理過程簡單、效率高、血漿用量少的優(yōu)點(diǎn)，且回收率明顯高于液液萃取法且更穩(wěn)定[19]，故最終采用該法進(jìn)行樣品前處理。

3.3 基質(zhì)效應(yīng)的改善

蛋白沉淀法的缺點(diǎn)是基質(zhì)效應(yīng)明顯[19]。為了盡可能消除基質(zhì)的影響，本研究首先采用梯度洗脫方式，通過優(yōu)化水相和有機(jī)相的比例、調(diào)整兩者比例變化的快慢，盡可能地將PPD與基質(zhì)中的干擾物分離，從而減小基質(zhì)的影響;其次，篩選合適的內(nèi)標(biāo)，通過比較地高辛、地塞米松、氯唑沙宗、非那雄胺等多個化合物，最終確定非那雄胺最為合適;最后，在滿足測定條件的前提下盡可能增加沉淀劑體積，一般情況下沉淀劑乙腈-血漿體積比超過1.5 ∶ 1即可滿足蛋白沉淀的要求，但在這種情況下基質(zhì)的影響也較大，所以本方法采用乙腈-血漿體積比3 ∶ 1進(jìn)行沉淀，以進(jìn)一步減小基質(zhì)的影響。

3.4 定量方法的應(yīng)用

不同劑量人參皂苷CK片在RA患者體內(nèi)的藥動學(xué)試驗結(jié)果均表明，與給藥第1天比較，代謝產(chǎn)物PPD在多劑量給藥第84天時的cmax和AUC0-t均明顯增加，tmax明顯縮短，說明PPD在體內(nèi)可能存在蓄積現(xiàn)象，與已有文獻(xiàn)[20]報道相符。

本研究建立的PPD定量分析方法按照國內(nèi)外相關(guān)指導(dǎo)原則[18，21-22]進(jìn)行了完整的方法學(xué)驗證，包括全血穩(wěn)定性、分析批長度等，而迄今已報道的PPD濃度測定方法均沒有全血穩(wěn)定性考察。本研究建立的方法已成功用于人參皂苷CK片的臨床ⅠB期研究，且在臨床試驗樣品檢測過程中還開展了試驗樣品再分析（ISR）檢測，ISR為100%。

綜上所述，本研究成功建立了人血漿中PPD濃度的測定方法，且方法靈敏、準(zhǔn)確、穩(wěn)定，操作簡便，血漿用量少，可用于人參皂苷CK等二醇型人參皂苷的臨床藥動學(xué)研究。

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（收稿日期：2021-05-25 修回日期：2021-08-26）

（編輯：鄒麗娟）