使用液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC－MS/MS）對(duì)食品中花青素進(jìn)行定量分析的方法研究

姚軍 葉紅玲 馬力 馮莉

花青素是食品中常見(jiàn)的一類強(qiáng)有力的抗氧化劑，目前針對(duì)花青素比較常用的檢測(cè)方法都有一定的不足之處，無(wú)法避免其它有機(jī)物質(zhì)干擾檢測(cè)結(jié)果的問(wèn)題。為此，本文依據(jù)原農(nóng)業(yè)部標(biāo)準(zhǔn)《植物源性食品中花青素的測(cè)定 高效液相色譜法》提供的檢驗(yàn)方法，研究使用液相串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）對(duì)食品中的花青素進(jìn)行定量分析。

一、材料與方法

1.儀器和試劑。（1）儀器：安捷倫6460三重串聯(lián)四級(jí)桿液質(zhì)聯(lián)用儀，ESI源。（2）標(biāo)樣：飛燕草色素標(biāo)準(zhǔn)品，矢車菊色素標(biāo)準(zhǔn)品，矮牽牛色素標(biāo)準(zhǔn)品，芍藥素標(biāo)準(zhǔn)品，天竺葵色素標(biāo)準(zhǔn)品，錦葵色素標(biāo)準(zhǔn)品。（3）試劑：質(zhì)譜純級(jí)甲酸，質(zhì)譜純級(jí)甲醇，優(yōu)級(jí)純鹽酸，優(yōu)級(jí)純抗壞血酸，超純水。

2.試樣及標(biāo)液制備。將以植物為原料的食品經(jīng)過(guò)粉碎均質(zhì)后，稱取2g左右置于50mL比色管中，加入乙醇∶水∶鹽酸混合液（2∶1∶1）50mL，沸水浴50min，使得花色苷酸解轉(zhuǎn)化為花青素。冷卻后用水定容至50mL，倒入離心管中5000轉(zhuǎn)離心，取上清液2.0mL，加入純水10mL混勻，先用1%氨水中和，再用1%抗壞血酸甲醇液定容至25mL，經(jīng)0.22μm的尼龍濾膜過(guò)濾待測(cè)?；旌蠘?biāo)樣用1%抗壞血酸甲醇配置成相應(yīng)濃度的標(biāo)液。

3.色譜及質(zhì)譜條件。（1）色譜條件。色譜柱：C18色譜柱（1.8μm，2.1mm×100mm）;流動(dòng)相A：體積百分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸水溶液;流動(dòng)相B：體積百分?jǐn)?shù)為0.1%的甲酸甲醇溶液。梯度洗脫：洗脫時(shí)間為11min，0-5min時(shí)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的比例從80∶20到50∶50;5-7min時(shí)流動(dòng)相A與流動(dòng)相B的比例從50∶50到10∶90，保持1分鐘;8-9分鐘時(shí)流動(dòng)相A與流動(dòng)相的B比例從10∶90到80∶20，保持2分鐘。（2）質(zhì)譜條件。離子源：ESI（+）;干燥氣溫度：350℃;干燥氣流量：6L/min;霧化氣壓力：40psi;離子噴霧電壓：3500V;掃描范圍（M/Z）：50-1500。

二、結(jié)果和討論

1.經(jīng)過(guò)優(yōu)化掃描條件，得出了6種花青素的定性定量離子對(duì)，如表1所示。

2.使用濃度分別為0.1mg/L、0.2mg/L、0.4mg/L、0.6mg/L、0.8mg/L、1.0mg/L、2.0mg/L、4.0mg/L的花青素混合標(biāo)液進(jìn)行檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果如表2所示。

3.從檢測(cè)出的數(shù)據(jù)可以得出6種花青素標(biāo)液在0.2mg/L-2.0mg/L的濃度范圍內(nèi)成線性關(guān)系，其相關(guān)系數(shù)如表3所示。使用液相質(zhì)譜/質(zhì)譜對(duì)物質(zhì)進(jìn)行定量分析，一般曲線相關(guān)系數(shù)不低于0.995，而此次檢測(cè)得出6種花青素標(biāo)液在0.2mg/L-2.0mg/L濃度范圍內(nèi)的標(biāo)準(zhǔn)曲線相關(guān)系數(shù)皆達(dá)到0.998以上，符合定量檢測(cè)的要求。

4.通過(guò)檢測(cè)可以得出樣品中各種花青素的含量，其之和即為樣品中的花青素含量。標(biāo)準(zhǔn)品及樣品檢測(cè)圖譜和標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1-圖4所示。

由于食品成分的復(fù)雜性，花青素只是食品中天然色素的一部分，以植物為原料的食品中還富含其它類的色素，再加上檢測(cè)的幾種主要花青素的極性相近，使用常規(guī)的液相方法很難去除其它色素的干擾以及定性各種花青素主要成分。圖1和圖2是通過(guò)LS-MS/MS法并采用文中所示條件檢測(cè)的6種主要花青素混標(biāo)和藍(lán)莓樣品的檢測(cè)色譜圖，從中可以看出液相色譜柱并不能完全分離各種花青素，并且有其它色素在相同時(shí)間出峰產(chǎn)生干擾。而使用ESI源的多反應(yīng)檢測(cè)掃描模式（MRM），根據(jù)表1所示的定量及定性離子對(duì)，花青素的定量及定性離子色譜圖如圖3所示。通過(guò)對(duì)不同濃度的花青素混合標(biāo)液進(jìn)行定量測(cè)量，從而得出在濃度為0.2mg/L-2.0mg/L時(shí)響應(yīng)值呈線性關(guān)系，可以作為檢測(cè)食品中花青素含量的方法使用，為分析植物源性食品中所含主要花青素的類別及含量測(cè)定提供了檢測(cè)依據(jù)。