雙心方治療心肌梗死后抑郁的網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)研究*

黃樂(lè)曦，杜泓森，靳會(huì)會(huì)，安瑩，賈靜蕓，侯季秋，陳雅麗，趙海濱

1.北京中醫(yī)藥大學(xué)，北京 100029；2.西安市中醫(yī)醫(yī)院，陜西 西安 710021；3.北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院，北京 100078

心肌梗死是冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病最嚴(yán)重的表現(xiàn)，全世界每年有700多萬(wàn)人受到影響［1］。2019年的一項(xiàng)薈萃分析表示，根據(jù)隨機(jī)效應(yīng)模型，在心肌梗死患者中合并抑郁癥的發(fā)病率為28.70%（95%CI：22.39%～35.46%）［2］。針對(duì)心肌梗死后抑郁，西醫(yī)多采取冠狀動(dòng)脈粥樣硬化性心臟病二級(jí)預(yù)防結(jié)合抗抑郁藥物的治療方式，但其療效有限且不良反應(yīng)大［3－4］。中醫(yī)在“雙心同治”方面，具有較好的應(yīng)用前景［5－7］。在中醫(yī)學(xué)中，心肌梗死歸屬“真心痛”，抑郁歸屬“郁病”，血液瘀滯、心脈不通則生真心痛；氣機(jī)郁結(jié)、心神不寧則致郁病，治療上當(dāng)祛瘀調(diào)神。北京中醫(yī)藥大學(xué)東方醫(yī)院趙海濱教授根據(jù)多年臨證經(jīng)驗(yàn)，創(chuàng)制了“雙心同治”的雙心方，由丹參、川芎、酸棗仁、百合組成，其在實(shí)際應(yīng)用中取得了很好的臨床療效［8］?，F(xiàn)代藥理研究表明，丹參與川芎配伍有改善微循環(huán)、擴(kuò)張血管、改善血液黏度等血管保護(hù)作用［9－10］。百合與酸棗仁均有抗焦慮抑郁、鎮(zhèn)靜安神、抗炎、抗應(yīng)激損傷等作用［10－12］。

網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)可系統(tǒng)分析藥物治療疾病的作用機(jī)制，挖掘現(xiàn)有藥物的新適應(yīng)證或預(yù)測(cè)新藥靶點(diǎn)，符合中醫(yī)整體調(diào)治機(jī)體的理念［13］。筆者首次應(yīng)用網(wǎng)絡(luò)藥理學(xué)方法，探究雙心方治療心肌梗死后抑郁的活性藥物成分及作用機(jī)制，現(xiàn)報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 藥物成分與靶點(diǎn)獲取從中藥系統(tǒng)藥理學(xué)數(shù)據(jù)庫(kù)及分析平臺(tái)（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）［14］中查詢雙心方中藥物（丹參、川芎、酸棗仁、百合）的所有成分，以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、類藥性（drug－likeness，DL）≥0.18為標(biāo)準(zhǔn)篩得本方的有效活性成分。根據(jù)該成分結(jié)果，從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中檢索獲取每個(gè)成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并通過(guò)UniProt數(shù)據(jù)庫(kù)將其進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)化。

1.2 疾病靶點(diǎn)獲取從GeneCards、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索心肌梗死和抑郁的相關(guān)靶點(diǎn)并取交集，獲得心肌梗死后抑郁的靶點(diǎn)。

1.3 潛在作用靶點(diǎn)獲取與網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建將雙心方的作用靶點(diǎn)與心肌梗死后抑郁的靶點(diǎn)取交集，以韋恩圖形式呈現(xiàn)結(jié)果，并使用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建藥物－成分－潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)。

1.4 蛋白質(zhì)相互作用網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建及核心靶點(diǎn)篩選

利用STRING數(shù)據(jù)庫(kù)［15］構(gòu)建潛在作用靶點(diǎn)的蛋白質(zhì)相互作用（protein－protein interaction，PPI）網(wǎng)絡(luò)。應(yīng)用Cytoscape 3.8.2軟件對(duì)網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治?，以“中介中心性”（betweenness centrality）、“接近中心性”（closeness centrality）、“度”（degree）均大于中位數(shù)為規(guī)則，篩選核心靶點(diǎn)。

1.5 富集分析采用DAVID V6.8數(shù)據(jù)庫(kù)［16－17］對(duì)潛在作用靶點(diǎn)進(jìn)行基因本體論（gene ontology，GO）和京都基因與基因組百科全書(shū)（kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）富集分析。同時(shí)，使用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物－成分－核心靶點(diǎn)－通路網(wǎng)絡(luò)。

2 結(jié)果

2.1 雙心方有效成分從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)內(nèi)檢索得雙心方的化學(xué)成分508個(gè)，根據(jù)OB≥30%、DL≥0.18篩得各藥有效成分：丹參65個(gè)，川芎7個(gè)，酸棗仁9個(gè)，百合7個(gè)，合并去重后共88個(gè)有效成分。將成分以DL值降序排列，展示各中藥DL值排名前5的成分（表1）。

表1 雙心方部分有效成分

2.2 雙心方潛在作用靶點(diǎn)從TCMSP數(shù)據(jù)庫(kù)中查詢雙心方成分所對(duì)應(yīng)的作用靶點(diǎn)，并結(jié)合文獻(xiàn)補(bǔ)充后得：丹參137個(gè)，川芎28個(gè)，酸棗仁32個(gè)，百合57個(gè)，合并去重后共154個(gè)。在GeneCards、PharmGKB數(shù)據(jù)庫(kù)中分別檢索整合得到心肌梗死靶點(diǎn)1 574個(gè)，抑郁靶點(diǎn)4 275個(gè)，兩者交集靶點(diǎn)1 117個(gè)。將雙心方靶點(diǎn)與心肌梗死后抑郁靶點(diǎn)取交集，獲得潛在作用靶點(diǎn)89個(gè)（圖1）。

圖1 藥物與疾病靶點(diǎn)韋恩圖

2.3 藥物－成分－潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)構(gòu)建應(yīng)用Cytoscape 3.8.2軟件構(gòu)建藥物—成分—潛在作用靶點(diǎn)網(wǎng)絡(luò)（圖2），共涉及166個(gè)節(jié)點(diǎn)和666條邊。網(wǎng)絡(luò)顯示，雙心方的73個(gè)成分與潛在靶點(diǎn)之間存在相互關(guān)系，其中木樨草素（degree＝39）、丹參酮IIa（degree＝29）、β－谷甾醇（degree＝23）等為雙心方治療心肌梗死后抑郁的主要活性成分，在治療心肌梗死后抑郁中發(fā)揮著核心作用。

圖2 藥物－成分－潛在作用靶點(diǎn)

2.4 潛在作用靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)分析及核心靶點(diǎn)篩選在STRING數(shù)據(jù)庫(kù)中構(gòu)建PPI網(wǎng)絡(luò)（圖3）。對(duì)該網(wǎng)絡(luò)進(jìn)行拓?fù)浞治觯浴爸薪橹行男浴薄敖咏行男浴薄岸取本笥谥形粩?shù)為規(guī)則，進(jìn)行2次篩選后（圖4），得到雙心方治療心肌梗死后抑郁的10個(gè)核心作用靶點(diǎn)，并按照度值降序排列（表2）。

圖3 PPI網(wǎng)絡(luò)

圖4 核心靶點(diǎn)篩選

表2 核心靶點(diǎn)

2.5 GO和KEGG富集分析運(yùn)用DAVID V6.8數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行GO和KEGG富集分析，以P＜0.01為篩選標(biāo)準(zhǔn)，分別獲得生物學(xué)過(guò)程（biological process，BP）條目229條和信號(hào)通路34條。

GO富集分析結(jié)果顯示，與心肌梗死后抑郁密切相關(guān)的生物學(xué)過(guò)程，包括對(duì)缺氧的反應(yīng)、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管生成、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的調(diào)控、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)控等。按P值升序排列，可視化前20個(gè)條目的結(jié)果（圖5）。

圖5 GO－BP富集分析排名前20的條目

KEGG富集分析結(jié)果顯示，與心肌梗死后抑郁密切相關(guān)的信號(hào)通路有34條，如HIF－1、PI3K／Akt等（表3，圖6）。可以看出，雙心方是通過(guò)多條信號(hào)通路對(duì)心肌梗死后抑郁產(chǎn)生治療效應(yīng)。應(yīng)用Cytoscape 3.8.2構(gòu)建藥物—成分—核心靶點(diǎn)—疾病網(wǎng)絡(luò)（圖7）。

圖6 KEGG富集分析核心通路

圖7 藥物－成分－核心靶點(diǎn)－通路網(wǎng)絡(luò)

表3 核心通路富集結(jié)果

3 討論

心肌梗死后抑郁發(fā)病率高，危害嚴(yán)重，臨床治療以心肌梗死后基礎(chǔ)用藥聯(lián)合抗抑郁藥物為主，但該方案存在患者依從性差，可誘發(fā)致死性心律失常以及增加不良心血管事件發(fā)生率等問(wèn)題，因此仍需探索更加安全有效的治療手段。中醫(yī)歷史悠久，博大精深，對(duì)心肌梗死后抑郁有較好的治療前景。雙心方中丹參祛瘀活血，川芎活血行氣，百合養(yǎng)陰清心安神，酸棗仁養(yǎng)血安神。全方藥味精煉，藥效集中，共收祛瘀調(diào)神之效。

本研究共篩選出雙心方中有效活性成分88個(gè)，其中主要包括木樨草素、丹參酮IIa、β－谷甾醇等。研究表明，木樨草素具有心臟保護(hù)作用，可抑制心臟細(xì)胞凋亡［18］，同時(shí)可以通過(guò)清除腦內(nèi)氧自由基和過(guò)氧化氫，重建腦內(nèi)的氧化／抗氧化系統(tǒng)平衡，減少氧化應(yīng)激對(duì)神經(jīng)元的損傷，從而治療抑郁［19］；丹參酮IIA可保護(hù)心肌細(xì)胞免受氧化應(yīng)激觸發(fā)的損傷和凋亡［20］，同時(shí)可以通過(guò)ERK－CREB－BDNF信號(hào)通路來(lái)發(fā)揮抗抑郁作用［21］；β－谷甾醇可通過(guò)增強(qiáng)抗氧化防御系統(tǒng)并有效降低人的血清膽固醇水平發(fā)揮心血管保護(hù)作用［22］。

通過(guò)構(gòu)建潛在交集靶點(diǎn)的PPI網(wǎng)絡(luò)，篩選獲得雙心方治療心肌梗死抑郁的10個(gè)核心靶點(diǎn)，具體包括絲氨酸／蘇氨酸激酶1（protein kinase Bα，AKT1）、白細(xì)胞介素－6（interleukin－6，IL－6）、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（vascular endothelial growth factor A，VEGFA）、細(xì)胞腫瘤抗原P53（tumor protein p53，TP53）、絲裂原活化蛋白激酶1（mitogen－activated protein kinase 1，MAPK1）、原癌基因c－fos（protooncogene c－Fos，F(xiàn)OS）、表皮生長(zhǎng)因子受體（epidermal growth factor receptor，EGFR）、腫瘤壞死因子（tumor necrosis factor，TNF）、前列腺素G／H合成酶2（prostaglandin－endoperoxide synthase 2，PTGS2）、內(nèi)皮素1（endothelin 1，EDN1）。AKT1，又稱蛋白激酶B，其激活依賴于PI3K，是PI3K／AKT通路中的重要節(jié)點(diǎn)，調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、存活、生長(zhǎng)、代謝以及血管生成等多個(gè)生物學(xué)過(guò)程［23－25］，可在心肌梗死的病理過(guò)程中發(fā)揮心肌保護(hù)、血管新生等作用［26］，而且還能通過(guò)調(diào)控Nrf2／BDNF和GSK3β／β－catenin等發(fā)揮抗抑郁作用［27－28］；IL－6具有多種功能，可通過(guò)促血小板聚集與冠狀動(dòng)脈平滑肌細(xì)胞增殖等多種機(jī)制，加重心肌梗死病情［29］，同時(shí)可使下丘腦－垂體－腎上腺活動(dòng)過(guò)度而致抑郁［30］；血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）是最重要的血管生成因子，可促進(jìn)梗死心臟的修復(fù)［31］，同時(shí)有抗抑郁作用，當(dāng)VEGF表達(dá)下降時(shí)可導(dǎo)致抑郁癥的發(fā)生［32］；MAPK1屬于MAP激酶家族，與心肌梗死后的炎癥反應(yīng)息息相關(guān)［33］，且其表達(dá)降低與導(dǎo)致抑郁的發(fā)生相關(guān)［34］；原癌基因c－fos是神經(jīng)功能活動(dòng)的代謝性標(biāo)志物，正常情況下在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可有較低水平的表達(dá)，而在抑郁情況下表達(dá)增加，降低其表達(dá)可改善抑郁［35－36］；EGFR突變可能會(huì)降低抑郁的發(fā)生率［37］；TNF與心肌梗死后炎癥及其誘導(dǎo)的自噬和凋亡相關(guān)［38］，且當(dāng)抑郁發(fā)生時(shí)其表達(dá)增加［39］；PTGS是前列腺素合成的限速酶，其被抑制時(shí)可減少炎癥反應(yīng)并改善心肌梗死后的心肌重塑［40］，減少炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和神經(jīng)元死亡［41］；內(nèi)皮素可促進(jìn)血管收縮和細(xì)胞增殖，并與高血壓和冠狀動(dòng)脈疾病有關(guān)。

GO和KEGG富集分析進(jìn)一步揭示了雙心方治療心肌梗死后抑郁的作用機(jī)制。GO富集分析顯示，雙心方治療心肌梗死后抑郁主要涉及缺氧應(yīng)答、炎癥反應(yīng)、氧化應(yīng)激、血管生成、心肌細(xì)胞和神經(jīng)元細(xì)胞凋亡的調(diào)控、活性氧代謝過(guò)程的調(diào)控等生物學(xué)過(guò)程；而KEGG富集分析發(fā)現(xiàn)，雙心方主要通過(guò)HIF－1信號(hào)通路、PI3K／Akt信號(hào)通路等對(duì)心肌梗死后抑郁發(fā)揮治療作用。缺氧誘導(dǎo)因子－1（hypoxia inducible factor－1，HIF－1）是HIF－1信號(hào)通路中的關(guān)鍵因子，其在常氧狀態(tài)下容易分解，但在低氧狀態(tài)下轉(zhuǎn)錄活性和穩(wěn)定性都顯著提高，可通過(guò)誘導(dǎo)血管生成而增加缺血區(qū)心肌供血，縮小心肌梗死范圍［42－43］；同時(shí)，實(shí)驗(yàn)研究顯示，抑郁組大鼠腦內(nèi)HIF－1α表達(dá)較正常組顯著增高，說(shuō)明腦組織相對(duì)缺氧而反饋性引起HIF－1α蛋白上調(diào)，表明HIF－1與抑郁的發(fā)生亦有一定的相關(guān)性［44］。PI3K／AKT是介導(dǎo)細(xì)胞存活、生長(zhǎng)和凋亡的關(guān)鍵信號(hào)通路。PI3K，即磷脂酰肌醇3－激酶，其磷酸化后可活化下游的AKT。AKT是絲氨酸／蘇氨酸蛋白激酶的成員，活化后參與細(xì)胞存活、周期和生長(zhǎng)的調(diào)控，其下游底物GSK3β蛋白可通過(guò)降低促凋亡蛋白Bax的表達(dá)和凋亡標(biāo)志物caspase3的活化，并增加抗凋亡蛋白Bcl－2的表達(dá)，從而產(chǎn)生抗心肌細(xì)胞凋亡效應(yīng)［45］，同時(shí)，GSK3β還可上調(diào)海馬中β連環(huán)蛋白的水平，從而改善抑郁［46］。

以上研究結(jié)果表明，通過(guò)HIF－1、PI3K／Akt等多條信號(hào)通路介導(dǎo)，雙心方中的多重活性成分有心臟保護(hù)作用，可通過(guò)抗心肌細(xì)胞凋亡、抗炎、抗氧化應(yīng)激反應(yīng)，促進(jìn)梗死后心臟內(nèi)的血管生成等，治療心肌梗死及改善預(yù)后，通過(guò)抑制神經(jīng)元的氧化應(yīng)激損傷，減少炎癥介導(dǎo)的細(xì)胞毒性和神經(jīng)元死亡等改善抑郁。本研究尚存不足，僅從理論層面探討雙心方的作用機(jī)制，且數(shù)據(jù)庫(kù)檢索范圍小等因素亦會(huì)導(dǎo)致研究結(jié)果有偏差。因此，本研究團(tuán)隊(duì)今后將進(jìn)一步通過(guò)實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證本研究結(jié)果。