益氣溫陽方聯合順鉑對Lewis荷瘤小鼠抗腫瘤的作用及對Th1／Th2平衡的影響*

王霖，孫增濤，張召楊，劉偉，郭思佳，張虹

1.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617；2.天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院，天津 300250

腫瘤已成為目前威脅人類健康的主要殺手之一，其中肺癌是全球癌癥引起死亡最常見的原因之一。據統計，我國城市居民惡性腫瘤的發(fā)病率及死亡率，肺癌位于首位［1］。順鉑是臨床最常用的含鉑類抗腫瘤藥物之一，主要通過抑制DNA合成、誘導細胞凋亡來殺傷腫瘤細胞［2］。然而，順鉑的免疫抑制作用也不容忽視。研究表明，順鉑可以抑制T細胞等免疫調節(jié)細胞增殖，進一步引發(fā)腫瘤微環(huán)境中Th1／Th2失衡，破壞人體免疫調節(jié)功能［3］。Th1／Th2失衡是腫瘤免疫的關鍵環(huán)節(jié)，在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中起到重要作用［4］。

中醫(yī)藥治療疾病本著“治病求本”的原則，強調“整體觀念”和“辨證論治”［5］。治療肺癌的過程中更注重患者的主觀感受，始終以“癥狀”為靶標。雖然消瘤作用較弱，但通過調節(jié)機體，可穩(wěn)定瘤體、緩解癥狀、增強體質、提高患者的生存質量、延長生存期，達到長期“帶瘤生存”的目的［6］。在中醫(yī)整體觀思想指導下，探討中藥復方對機體免疫功能的影響。研究發(fā)現，中醫(yī)藥可以通過逆轉Th1／Th2失衡狀態(tài)，達到抗腫瘤［7－8］的作用。本研究以益氣溫陽方聯合順鉑干預Lewis肺癌荷瘤小鼠，觀察其對腫瘤的抑制作用及對Th1、Th2相關細胞因子的影響。

1 材料

1.1 動物及細胞SPF級雄性C57BL／6小鼠32只，體質量（18.0±2.0）g，購于北京維通利華實驗動物技術有限公司，許可證號：SYXK（津）：2019－0002。飼養(yǎng)于室溫（25±2）℃，濕度50%～60%的條件下，給予無菌飼料及無菌水。實驗設計和操作經過實驗動物倫理委員會審核，倫理批號：IRMDWLL－2019140。小鼠Lewis肺癌瘤株購于中國科學院上海生命科學研究院。

1.2 藥物與試劑益氣溫陽方（由黃芪、肉蓯蓉、淫羊藿、黨參、薏苡仁、莪術、虎杖、雞內金、桔梗、甘草組成，天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥房提供）；順鉑注射液（齊魯制藥有限公司，批號：8K029A89）；白細胞介素－2（interleukin－2，IL－2）、白細胞介素－4（interleukin－4，IL－4）、白細胞介素－10（interleukin－10，IL－10）、干擾素－γ（interferon－γ，IFN－γ）ELISA試劑盒（武漢華美生物工程有限公司，貨號分別為：CSB－E04627m、CSB－E04634m、CSB－E04594m、CSB－E04578m）；胎牛血清（武漢普諾賽生命科技有限公司，貨號：164210）；RPMI 1640培 養(yǎng) 基（Thermo Fisher Scientific，貨 號：11875101）。

1.3 儀器MCO－175型CO2細胞培養(yǎng)箱（日本Sanyo公司）；MP502型電子天平（上海民橋精密科學儀器有限公司）；ECLIPSE TS100型光學顯微鏡（日本Nikon公司）。

2 方法

2.1 藥物的制備益氣溫陽方由天津中醫(yī)藥大學第二附屬醫(yī)院藥房將藥物制成顆粒劑，用蒸餾水配置成含生藥2 g·mL－1的藥液，4℃保存；順鉑注射液經生理鹽水配置含順鉑0.4 g·L－1的藥液。

2.2 小鼠Lewis肺癌細胞體外培養(yǎng)細胞復蘇時取液氮保存的小鼠Lewis肺癌瘤株37℃水浴融化，加入完全培養(yǎng)液（89%1640培養(yǎng)液＋10%胎牛血清＋1%青霉素／鏈霉素），于37℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日換液，融合至80%左右時用胰酶消化傳代，3 d傳代1次。

2.3 小鼠分組及模型建立將培養(yǎng)后的Lewis細胞用胰蛋白酶消化，調整細胞濃度至約1×107mL－1。每只小鼠接種前，充分搖勻瘤細胞懸液，于小鼠右腋窩皮下接種瘤細胞懸液0.2 mL，30 min內接種完畢。

造模結束后給藥，將32只小鼠分為4組，即模型組、益氣溫陽方組（20 g·kg－1）、順鉑組（4 mg·kg－1）及聯合用藥組（益氣溫陽方＋順鉑），每組8只，連續(xù)給予相應的藥物12 d。模型組給予同體積的生理鹽水模型組：每天灌胃生理鹽水0.4 mL，連續(xù)12 d；順鉑組：第1天、第3天、第5天每只小鼠腹腔注射順鉑注射液0.2 mL。

2.4 檢測小鼠血清IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ水平采用摘眼球法取小鼠血液，靜置后，離心，取上清，ELISA試劑盒檢測小鼠血清中IL－2、IL－4、IL－10及IFN－γ水平。

2.5 計算抑瘤率、胸腺指數及脾臟指數小鼠取血后將其頸椎脫臼處死。取材時，將瘤組織取出后，先進行拍照，后置于生理鹽水中稍稍漂洗殘血，稱重并記錄數據。收集小鼠胸腺及脾臟，置于生理鹽水中稍稍漂洗殘血，稱重并記錄數據。按以下公式計算抑瘤率、胸腺指數及脾臟指數。

抑瘤率＝［模型組平均瘤質量（g）－實驗組平均瘤質量（g）］／模型組平均瘤質量（g）×100%

胸腺指數＝胸腺質量（mg）／體質量（g）；脾臟指數＝脾臟質量（mg）／體質量（g）。

2.6 對小鼠腫瘤組織形態(tài)學變化的影響將腫瘤組織于10%中性福爾馬林固定，石蠟包埋、切片，按HE染色的步驟進行操作。置于光鏡下觀察腫瘤組織形態(tài)變化。

2.7 統計學方法采用SPSS 21.0統計軟件進行數據處理，計量資料以平均值±標準差（±s）表示，組間比較采用單因素方差分析（One－Way ANOVA），方差齊時選用LSD法，方差不齊時選Dunnett′s法。以P＜0.05為差異有統計學意義。

3 結果

3.1 對小鼠瘤質量及抑瘤率的影響與模型組比較，益氣溫陽方組、順鉑組、聯合用藥組小鼠瘤質量均顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，聯合用藥組小鼠瘤質量顯著降低（P＜0.01），抑瘤效果最佳。益氣溫陽方組，順鉑組及聯合用藥組抑瘤率分別為39.52%、61.23%、74.51%。見表1、圖1。

圖1 小鼠的移植瘤

表1 對小鼠瘤質量及抑瘤率的影響 （±s）

表1 對小鼠瘤質量及抑瘤率的影響 （±s）

注：與模型組比較，**P＜0.01；與順鉑組比較，△△P＜0.01

組別 n 瘤質量（m／g） 抑瘤率／%模型組8 1.56±0.17－益氣溫陽方組 8 0.70±0.18** 39.52順鉑組 8 0.44±0.09** 61.23聯合用藥組 8 0.29±0.08**△△74.51

3.2 對小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響與模型組比較，順鉑組小鼠胸腺指數顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，聯合用藥組小鼠胸腺指數顯著升高（P＜0.01）。與模型組比較，順鉑組小鼠脾臟指數顯著降低（P＜0.01），聯合用藥組小鼠脾臟指數明顯降低（P＜0.05）；與順鉑組比較，聯合用藥組小鼠脾臟指數顯著升高（P＜0.01）。見表2。

表2 對小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響（±s）

表2 對小鼠胸腺指數、脾臟指數的影響（±s）

注：與模型組比較，*P＜0.05，**P＜0.01；與順鉑組比較，△P＜0.01，△△P＜0.01

組別 n 胸腺指數 脾臟指數模型組8 1.98±0.25 4.51±0.88益氣溫陽方組 8 2.08±0.15 5.21±0.78順鉑組 8 1.28±0.43** 3.09±0.23**聯合用藥組 8 2.27±0.34△△ 3.78±0.36*△△

3.3 對小鼠腫瘤組織病理學變化的影響模型組小鼠腫瘤組織未見明顯壞死區(qū)域，免疫細胞浸潤不明顯，益氣溫陽方組、西藥組、聯合用藥組小鼠腫瘤組織均可見明顯壞死區(qū)域，免疫細胞浸潤增多。見圖2。

圖2 小鼠腫瘤組織病理學變化（HE）

3.4 對小鼠Th1相關細胞因子IL－2、IFN－γ水平的影響與模型組比較，益氣溫陽方組、聯合用藥組小鼠血清IL－2、IFN－γ水平均明顯升高（P＜0.05）；與順鉑組比較，聯合用藥組小鼠血清IL－2、IFN－γ水平均顯著升高（P＜0.01）。見表3。

表3 對小鼠Th1相關細胞因子IL－2、IFN－γ水平的影響 （xˉ±s，ng·L－1）

3.5 對小鼠Th2相關細胞因子IL－4、IL－10水平的影響與模型組比較，益氣溫陽方組小鼠血清IL－4、IL－10小鼠血清水平均明顯降低（P＜0.05），聯合用藥組小鼠血清IL－4、IL－10水平均顯著降低（P＜0.01）；與順鉑組比較，聯合用藥組小鼠血清IL－4、IL－10水平均顯著降低（P＜0.01）。見表4。

表4 對小鼠Th2相關細胞因子IL－4、IL－10表達水平的影響 （xˉ±s，ng·L－1）

4 討論

中國惡性腫瘤新發(fā)病例約430萬例，死亡病例約300萬例，分別約占全球的23.7%和30%，發(fā)病率和死亡率均高于全球平均水平［9］。出現這種現象的一個重要原因就是人口老齡化。我國是目前世界上老齡化進程較快，老年人口數量最多的國家［10］。2015年我國分地區(qū)惡性腫瘤發(fā)病和死亡數據顯示，惡性腫瘤的發(fā)病率從40歲以后均呈指數增長，其中肺癌的發(fā)病率和死亡率最高［11］。隨著人口老齡化的加劇，惡性腫瘤逐漸變成人類衛(wèi)生健康的一個重要負擔。因此，腫瘤既是一種“慢性病”，也是一種“老年病”。晚期肺癌患者常接受化療，化療藥物多寒涼、毒性大，亦損傷人體正氣，造成機體虛寒，陽氣虛弱［12］。中醫(yī)治療腫瘤也多以“清熱解毒”“以毒攻毒”“活血化瘀”為主，易損傷人體正氣且療效有限。老年體虛，本不耐攻伐。因此，在治療肺癌過程中，應以益氣溫陽扶助正氣，增強機體自身免疫功能以達到抗腫瘤的目的。

近些年腫瘤的研究熱點“免疫療法”逐漸認識到腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的免疫功能失調密切相關，強調惡性腫瘤不應完全以消除瘤體為目的，調動機體自身的免疫機能對抗腫瘤是治療腫瘤的關鍵［13］。《黃帝內經》有云“正氣存內，邪不可干，邪之所湊，其氣必虛”，主張“養(yǎng)正積自除”“衰其大半而止”，二者理論不謀而合。研究表明，扶正類中藥可以促進淋巴細胞、單核巨噬細胞、NK細胞等重要免疫細胞活化、調節(jié)多種細胞因子，增強機體免疫功能，防止腫瘤細胞免疫逃逸，從而發(fā)揮抗腫瘤作用［14－18］。

益氣溫陽方是天津中醫(yī)藥大學孫增濤教授基于多年的臨床經驗和本課題組前期的證候調查結果擬定的成方。益氣溫陽方以黃芪、淫羊藿、肉蓯蓉三者共為君藥，具有溫陽散寒、補氣健脾、益衛(wèi)固表的功效；臣藥以黨參、薏苡仁，二者共奏培土生金、補益肺脾之效；佐以莪術行氣破血、消癥止痛，虎杖祛風利濕、散瘀定痛、止咳化痰，二者寓意攻補兼施，起到補益、消瘤的雙重作用；雞內金健胃消食、固護脾胃，以防滋膩礙胃，并助化源；桔梗引諸藥上行肺經，以助藥力，與甘草共為使藥。全方溫而不燥、補而不峻、寓攻于補。本研究結果顯示，順鉑聯合益氣溫陽方可增強順鉑抑制腫瘤的作用，還可改善Lewis荷瘤小鼠因化療出現的脾臟指數、胸腺指數等免疫指標的下降。提示益氣溫陽方可以抑制腫瘤生長，提高小鼠的免疫功能，聯合順鉑可以起到協同作用。

在機體抗腫瘤的免疫反應中，輔助性T細胞在腫瘤的發(fā)生、發(fā)展過程中扮演著重要角色［19］，而Th1和Th2是輔助性T細胞最重要的兩個亞群［20］。Th1細胞分泌IL－2、IFN－γ等細胞因子，主要介導細胞免疫反應和遲發(fā)型超敏反應，對外源性病原體和腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中起到免疫防御作用。Th2細胞分泌IL－4、IL－10等細胞因子，主要參與體液免疫及變態(tài)反應等，與Th1細胞存在著拮抗作用，可促進腫瘤細胞的生長［21］。正常生理狀況下，Th1、Th2細胞存在著動態(tài)平衡，維持正常的機體的免疫功能。一旦Th1／Th2平衡狀態(tài)發(fā)生紊亂，當Th1型細胞因子分泌減少，而Th2型細胞因子分泌增多，惡性腫瘤的免疫逃逸就很可能會發(fā)生［22］。研究表明，Th1型細胞因子水平降低和或Th2型細胞因子水平升高與腫瘤惡性程度、預后不良密切相關［23］。

研究表明，中醫(yī)藥可以改善Th1／Th2偏移，增加Th1型細胞或者減少Th2細胞，參與抗腫瘤免疫［24］。研究發(fā)現，芪玉三龍湯可以升高荷瘤小鼠血清中IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，調控Th1／Th2動態(tài)平衡，改善免疫功能［25］。通過臨床收集中藥聯合化療治療肺癌合并惡性胸腔積液患者，檢驗血清發(fā)現，葶藶澤漆湯可以同時影響Th1、Th2型細胞因子的變化，通過升高IL－2水平、降低IL－4水平，改善Th1／Th2平衡狀態(tài)［26］。人參提取物人參皂苷Rg3可以抑制腫瘤血管生成，改善腫瘤患者血清Th1／Th2細胞失衡，輔助放療起到增效減毒的作用［27］。本研究結果顯示，益氣溫陽方可顯著升高Lewis荷瘤小鼠血清IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，增強Th1細胞功能并降低Th2功能，改善Th1／Th2的動態(tài)平衡。

綜上所述，益氣溫陽方對腫瘤生長具有一定的抑制作用，聯用順鉑可以提高療效、減輕順鉑不良反應，效果優(yōu)于單用順鉑。益氣溫陽方聯合順鉑可以升高小鼠血清IL－2、IFN－γ水平，降低IL－4、IL－10水平，提示益氣溫陽方聯合順鉑可以調節(jié)Th1、Th2相關細胞因子，從而逆轉Th1／Th2偏移，發(fā)揮免疫調節(jié)的功能，以達到抗腫瘤的目的。