耐萬(wàn)古霉素腸球菌耐藥基因、轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和多位點(diǎn)序列分析

王婧婧， 吳林清， 陳如壽， 王玉豐

（1.三亞中心醫(yī)院檢驗(yàn)科，海南 三亞 572000；2. 三亞中心醫(yī)院骨科，海南 三亞 572000）

腸球菌（Enterococcus）是醫(yī)院感染的常見(jiàn)條件致病菌。近年來(lái)，耐萬(wàn)古霉素腸球菌（vancomycin-resistant Enterococcus，VRE）感染率逐年上升，7%～10%的菌血癥由腸球菌感染引起[1-2]。VRE可引起人體多部位感染，主要是廣譜抗菌藥物選擇性的結(jié)果。VRE可通過(guò)血液感染或定植生長(zhǎng)方式進(jìn)行直接傳播，也可通過(guò)食物、醫(yī)療器械、污染環(huán)境、醫(yī)護(hù)人員接觸等方式間接傳播[2-5]。VRE包括耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌和耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌，有明顯的耐藥性，涉及VanA、VanB、VanD、VanM和VanN等表型，其中VanA、VanB表型最為常見(jiàn)[5]。了解VRE的耐藥基因、毒力基因、轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和多位點(diǎn)序列分型（multilocus sequence typing，MLST）等分子流行病特征，對(duì)VRE的防控和治療有重要價(jià)值。本研究擬探討92株VRE臨床分離株的耐藥基因、轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)和MLST型別，為有效防治VRE提供實(shí)驗(yàn)室依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 菌株來(lái)源

選取2017年6月—2020年6月三亞中心醫(yī)院分離自臨床樣本的耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌80株和糞腸球菌株12株。所有菌株分離后均保存在-80 ℃冰箱。

1.2 儀器與試劑

VITEK MS微生物鑒定系統(tǒng)、VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀（法國(guó)生物梅里埃公司），ABI 7500 PCR儀（美國(guó)ABI公司），PowerPac basic電泳儀（美國(guó)伯樂(lè)公司），chemolum 8300凝膠紫外成像分析系統(tǒng)（德國(guó)Biometra公司）。聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR）引物合成和測(cè)序由北京擎科生物科技公司完成。微量肉湯稀釋法微生物藥物敏感性試驗(yàn)試劑（溫州康泰生物公司），M-H瓊脂平板、質(zhì)控菌株大腸埃希菌（ATCC 8739）購(gòu)自通派（上海）生物科技有限公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種鑒定和細(xì)菌耐藥性、表型鑒定 將保存在-80℃冰箱中的菌株進(jìn)行復(fù)蘇，用一次性接種環(huán)取出1粒磁珠置于M-H瓊脂平板上進(jìn)行劃線接種，培養(yǎng)18～24 h后，挑取單個(gè)菌落，在靶孔中涂勻，在靶點(diǎn)上加入1 μL基質(zhì)液，待靶板完全干燥后，采用VITEK MS微生物鑒定系統(tǒng)鑒定菌種；采用VITEK 2 Compact自動(dòng)化鑒定藥敏儀測(cè)定菌株對(duì)萬(wàn)古霉素、氨芐西林、青霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素、利奈唑胺、鏈霉素、慶大霉素、奎奴普丁-達(dá)福普汀、呋喃妥因的藥物敏感性，嚴(yán)格按照儀器說(shuō)明書要求進(jìn)行操作，根據(jù)美國(guó)臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)（the Clinical and Laboratory Standards Institute，CLSI）2019年抗微生物藥物敏感性試驗(yàn)的執(zhí)行標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行藥物敏感性判定。采用微量肉湯稀釋法測(cè)定92株VRE對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的最小抑菌濃度（minimum inhibitory concentration，MIC），以MIC≤4 μg/mL為敏感，8～16 μg/mL為中介，≥32 μg/mL為耐藥；若結(jié)果為中介，則將菌液劃線于M-H瓊脂平板，培養(yǎng)24 h后觀察是否有菌落生長(zhǎng)，如萬(wàn)古霉素MIC>64 μg/mL，替拉考寧MIC≥32 μg/mL，可判斷為VanA表型。

1.3.2 耐藥基因型測(cè)定 提取腸球菌基因組DNA，采用PCR進(jìn)行萬(wàn)古霉素耐藥基因檢測(cè)，萬(wàn)古霉素耐藥基因引物包括：vanA（正向引物5'-CATGAATAGAATAAAAGTTGCAATA-3'，反向引物5'-CCCCTTTAACGCTAATACGATC AA-3'，1 030 bp），vanB（正向引物5'-GTGAC AAACCGGAGGCGAGGA-3'，反向引物5'-CCG CCATCCTCCTGCAAAAAA-3'，433 bp），vanD（正向引物5'-TAAGGCGCTTGCATATACC G-3'，反向引物5'-TGCAGCCAAGTATCCGGT AA-3'，461 bp）。反應(yīng)條件為：95 ℃ 5 min預(yù)變性；95 ℃ 30 s退火；55 ℃ 30 s延伸，72 ℃ 30 s延伸，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 7 min延伸，陽(yáng)性產(chǎn)物送華大基因公司進(jìn)行測(cè)序。

1.3.3 VRE毒力基因檢測(cè) 腸球菌毒力基因包括hyl、gelE、ace、efaA、asal、esp和cylA，采用多重PCR檢測(cè)VRE的毒力基因型分布特征和頻率，參照文獻(xiàn)[6]設(shè)計(jì)引物和反應(yīng)條件，擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.4 轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)分析Tn1546基因片段引物包括orf1、orf2-vanR、vanS-vanH、vanR-vanS、vanY-vanZ、vanX-vanY、vanH-vanA-vanX等管家基因引物，參照文獻(xiàn)[5]進(jìn)行引物合成，PCR擴(kuò)增后進(jìn)行測(cè)序鑒定。

1.3.5 MLST檢測(cè) 分別對(duì)屎腸球菌（adk、atpA、ddl、gyd、gdh、purK和pstK）和糞腸球菌（gyd、pstS、gki、xpt、aroE和yiqL）的管家基因進(jìn)行擴(kuò)增和測(cè)序，反應(yīng)條件和引物序列設(shè)計(jì)參照MLST網(wǎng)站（http：//www.pubmlst.org），對(duì)PCR陽(yáng)性產(chǎn)物進(jìn)行測(cè)序，基于MLST數(shù)據(jù)庫(kù)和eBURST V3軟件進(jìn)行序列和克隆復(fù)合群序列比對(duì)分析。

2 結(jié)果

2.1 VRE菌落生長(zhǎng)情況、抗菌藥物敏感性及耐藥表型結(jié)果

VRE在培養(yǎng)皿內(nèi)形成表面光滑、不透明、灰白色的圓形菌落，革蘭染色涂片鏡下觀察可見(jiàn)單個(gè)、短鏈狀或成對(duì)排列，VITEK MS微生物鑒定系統(tǒng)鑒定結(jié)果為80株屎腸球菌和12株糞腸球菌。體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，屎腸球菌和糞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率均為100.0%，對(duì)氨芐西林的耐藥率分別為97.5%和50.0%，2種腸球菌對(duì)青霉素、左氧氟沙星、環(huán)丙沙星、紅霉素、克林霉素、四環(huán)素、替加環(huán)素、利奈唑胺、鏈霉素、慶大霉素、奎奴普丁-達(dá)福普汀均耐藥，但對(duì)呋喃妥因較為敏感。92株腸球菌對(duì)14種抗菌藥物的耐藥性見(jiàn)表1。微量肉湯稀釋法檢測(cè)結(jié)果表明，92株VRE對(duì)萬(wàn)古霉素和替考拉寧的MIC分別為192～256和32～256 μg/mL，均為耐藥；根據(jù)MIC結(jié)果，考慮耐藥表型均為VanA表型。

表1 92株腸球菌對(duì)14種常用抗菌藥物的耐藥率

2.2 耐藥基因型和毒力基因型檢測(cè)結(jié)果

PCR擴(kuò)增結(jié)果顯示，92株VRE均為vanA耐藥基因型，未檢測(cè)到vanB和vanD耐藥基因型，所有菌株耐藥表型與基因型一致。毒力基因檢測(cè)結(jié)果顯示，esp基因所占比例最高（82.5%）；hyl、gelE、asal、cy1A、efaA和ace基因分別占42.5%、18.8%、15.0%、10.0%、15.0%和7.5%。80株屎腸球菌毒力基因型主要為esp（23株）、hyl（13株）、esp-hyl（29株）、esp-gelE（5株）、esp-asal（2株）、其他（8株）；糞腸球菌毒力基因型主要為：esp-cylA-gelE-asal-efaA（3株）、esp-ace-cylA-gelE-asal-efaA（2株）、esp-cylA-asal-efaA（2株）、ace-gelE-asal-efaA（2株）、ace-gelE-efaA（2株）、cylA-gelE-asal-efaA（1株）。

2.3 轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)檢測(cè)結(jié)果

80株耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌和12株耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌可分為A～E 5個(gè)型別。A型為orf1基因下游缺失。B型可以分為B1和B2亞型，B1亞型orf1和orf2基因完全缺失，且在vanX和vanY間反向插入IS1216V；B2亞型僅為orf1和orf2基因缺失。C型可以分為C1和C2亞型，C1亞型orf1、orf2和vanY-vanZ基因缺失，且vanX和vanY間反向插入IS1216V；C2亞型為orf1、orf2和vanY-vanZ基因完全缺失。D型為orf1、orf2、vanY-vanZ和vanX-vanY基因完全缺失。E型為orf1、orf2、vanS-vanH和vanR-vanS基因完全缺失，且vanX和vanY間反向插入ISl216V。

2.4 MLST檢測(cè)結(jié)果

MLST檢測(cè)和eBURST軟件分析結(jié)果顯示，92株VRE中共檢出7個(gè)ST型別：包括ST17（40/92，43.5%）、ST78（30/92，32.6%）、ST203（6/92，6.5%）、ST363（5/92，5.4%）、ST555（4/92，4.3%）、ST1392（4/92，4.3%）、ST1394（3/92，3.3%）；其中ST1392屬于克隆復(fù)合體CC192，ST17、ST78、ST203、ST363、ST5557均屬于CC78克隆復(fù)合體，而CC192和CC78均源于CC17克隆復(fù)合體。

3 討論

腸球菌是動(dòng)物腸道中的共生菌，也是可引起免疫功能低下患者院內(nèi)感染的條件致病菌。目前，屎腸球菌和糞腸球菌已對(duì)萬(wàn)古霉素、青霉素和替考拉寧等多種抗菌藥物產(chǎn)生抗性，快速識(shí)別耐藥細(xì)菌病原體及其特征在感染的防控工作中發(fā)揮著重要的作用，為提高對(duì)VRE的防控效率，早期預(yù)防其院內(nèi)傳播，必須盡快查明耐藥腸球菌的攜帶者[2，7-8]。激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜可快速鑒定細(xì)菌種類，在進(jìn)行常規(guī)微生物分析時(shí)，可以識(shí)別毒力生物標(biāo)志物的峰值，而不需要進(jìn)行額外的分析，也不需要延長(zhǎng)培養(yǎng)時(shí)間，在臨床微生物研究領(lǐng)域被廣泛應(yīng)用于細(xì)菌鑒定、分類和菌株分型[8-11]。

本研究采用VITEK MS微生物鑒定系統(tǒng)對(duì)92株VRE進(jìn)行菌株鑒定，結(jié)果為80株屎腸球菌和12株糞腸球菌。體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果顯示，92株腸球菌對(duì)14種臨床常用抗菌藥物均存在不同程度的耐藥，屎腸球菌和糞腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素的耐藥率均為100.0%，對(duì)氨芐西林的耐藥率分別為97.5%和50.0%，表明屎腸球菌比糞腸球菌更易產(chǎn)生耐藥性，但2種腸球菌對(duì)呋喃妥因均較敏感。本研究體外藥物敏感性試驗(yàn)結(jié)果提示，92株腸球菌對(duì)萬(wàn)古霉素均表現(xiàn)為較高水平的耐藥，微量肉湯稀釋法對(duì)VRE菌株進(jìn)行萬(wàn)古霉素和替拉考寧的MIC值測(cè)定結(jié)果顯示，92株VRE均屬于vanA耐藥表型，未檢測(cè)到vanB、vanD、vanM和vanN等其他表型，與以往研究結(jié)果[1，5-6]一致。攜帶毒力基因的菌株可在細(xì)菌間傳播而產(chǎn)生致病性，主要包括esp、hyl、gelE、asal、cy1A、efaA及ace等毒力基因型。本研究發(fā)現(xiàn)，VRE菌株以esp毒力基因型所占比例最高（82.5%），80株屎腸球菌以esp-hyl基因組合最常見(jiàn)，有92株，糞腸球菌以多基因組合為主，表明屎腸球菌和糞腸球菌毒力基因譜存在較大差異，但2種腸球菌的毒力基因相似，均攜帶多個(gè)基因或基因組合，屎腸球菌多以單一毒力基因?yàn)橹?，推測(cè)VRE可能通過(guò)不斷獲得新的毒力基因來(lái)不斷增強(qiáng)致病性[6，12-13]。

臨床上VRE最為常見(jiàn)的基因型為vanA和vanB型，耐藥基因可進(jìn)行水平傳播和轉(zhuǎn)移[4]。本研究通過(guò)PCR檢測(cè)結(jié)果證實(shí)了92株VRE均為vanA表型，經(jīng)測(cè)序證實(shí)所有菌株均為vanA耐藥基因型，未檢測(cè)到vanB和vanD耐藥基因型，與其耐藥表型一致。而相關(guān)研究結(jié)果顯示，vanA耐藥基因常位于轉(zhuǎn)座子Tn1546序列上，由轉(zhuǎn)座子介導(dǎo)的耐藥基因促使其在不同類型的菌株間進(jìn)行轉(zhuǎn)移和傳播，可能導(dǎo)致了萬(wàn)古霉素耐藥菌株的增多[5，14]。轉(zhuǎn)座子Tn1546是由orf1、orf2、vanS、vanR、vanY、vanZ、vanX、vanH和vanA 9個(gè)基因組成的長(zhǎng)為10 851 bp的序列，其中vanH、vanA和vanX與低親和力耐藥靶位有關(guān)，而轉(zhuǎn)座子Tn1546與點(diǎn)突變、不同的插入序列和基因缺失產(chǎn)生耐藥基因有關(guān)[15]。

本研究發(fā)現(xiàn)，80株耐萬(wàn)古霉素屎腸球菌和12株耐萬(wàn)古霉素糞腸球菌的Tn1546轉(zhuǎn)座子序列可分為5型，提示VRE因在這些位點(diǎn)發(fā)生基因缺失和插入序列等異質(zhì)性改變而產(chǎn)生耐藥。

MLST是通過(guò)擴(kuò)增相應(yīng)菌株的多個(gè)管家基因內(nèi)部的序列，并進(jìn)行測(cè)序來(lái)檢測(cè)管家基因是否發(fā)生菌株變異的分型方法。菌株的每個(gè)管家基因均根據(jù)其發(fā)現(xiàn)的時(shí)間順序來(lái)進(jìn)行等位基因命名，也就是該菌株管家基因譜的ST序列，MLST目前被廣泛用于細(xì)菌群體生物學(xué)、進(jìn)化和流行病學(xué)的研究中[1，5]。本研究在92株VRE中共發(fā)現(xiàn)7個(gè)ST型別，以ST17型和ST78最為常見(jiàn)，均屬于CC17克隆復(fù)合體，其中ST17型是目前最為流行的VRE的ST型別，其次是ST78型。CC17克隆復(fù)合群是VRE在不斷適應(yīng)環(huán)境的過(guò)程中逐漸進(jìn)化形成的，可在醫(yī)院內(nèi)廣泛傳播。因此，早期發(fā)現(xiàn)CC17克隆復(fù)合體腸球菌有助于有效控制耐藥菌株的廣泛傳播[1，5]。

綜上所述，VRE已成為院內(nèi)感染的主要致病菌，臨床上多以屎腸球菌和糞腸球菌為主，2種腸球菌感染模式不同，包括耐藥性、耐藥基因譜、毒力基因譜及其轉(zhuǎn)座子結(jié)構(gòu)、ST型別等的差異，但2種腸球菌耐藥基因和毒力基因攜帶率均較高，可引起醫(yī)院條件性感染。因此，加強(qiáng)對(duì)VRE耐藥性的流行病學(xué)特征及分子機(jī)制研究，對(duì)早期預(yù)防VRE的傳播具有重要作用。