眼部感染休斯頓分枝桿菌1例報(bào)道

王晶晶， 蔣曉飛， 馬逸珉， 王 蓓

（復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)科，上海 200040）

非結(jié)核分枝桿菌（non-tuberculosis Mycobacterium，NTM）是分枝桿菌屬（Mycobacterium）內(nèi)除結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis，MTB）復(fù)合群和麻風(fēng)分枝桿菌（Mycobacterium leprosy）以外的其他分枝桿菌，大部分為腐物寄生菌，僅少部分可使人體致病[1]。休斯頓分枝桿菌（Mycobacterium houstonense）是屬于偶發(fā)分枝桿菌（Mycobacterium fortuitum）的第3種生物變異復(fù)合體，是根據(jù)其表型和基因型數(shù)據(jù)定義的分枝桿菌基因型2分類的一個(gè)新的物種，與偶發(fā)分枝桿菌不存在抗藥性差異[2]。45%的偶發(fā)分枝桿菌臨床分離株第3種生物變異復(fù)合體和8種參考菌株分離自傷口，可引起皮膚及皮下軟組織病變[3]，其他菌株主要分離自呼吸道或血液樣本[2]。本文對(duì)1例休斯頓分枝桿菌感染病例進(jìn)行報(bào)道。

1 病例資料

患者，男，46歲，30年前無明顯誘因突然出現(xiàn)雙眼視物發(fā)紅，當(dāng)?shù)蒯t(yī)院診斷為雙眼玻璃體出血，具體治療不詳，左眼視力一直較差。10年前，患者突發(fā)左眼疼痛，于當(dāng)?shù)蒯t(yī)院行左眼青光眼手術(shù)。2016年9月因眼壓控制不佳在復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院就診，行左眼閥門植入。2個(gè)月前左眼紅痛、閥門管自行掉落，在其他診所給予“克林霉素，1.2 g靜滴”，左眼脹痛無明顯好轉(zhuǎn)。復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院門診檢查示：右眼視力1.0，左眼視力無光感；右眼眼壓2.26 kpa（17.0 mmHg），左眼眼壓無法測出；左眼角膜水腫，前房積膿，左眼角膜后沉淀物（+++），丁達(dá)爾現(xiàn)象（+++），瞳孔圓，眼內(nèi)結(jié)構(gòu)不見。B超檢查示“左眼玻璃體混濁，炎癥？視神經(jīng)萎縮？左眼軸長23.95 mm”。為進(jìn)一步診治，擬“左眼眼內(nèi)炎”收入院。2020年4月9日入院血常規(guī)檢查示：白細(xì)胞計(jì)數(shù)16.77×109/L。B超結(jié)果示“雙眼玻璃體混濁，左眼炎癥？視神經(jīng)萎縮？左眼眼軸長約23.95 mm”（圖1）。2020年4月10日行左眼眼內(nèi)容物剜除術(shù)，術(shù)中取玻璃體液培養(yǎng)，結(jié)果示：休斯頓分枝桿菌陽性，體外藥物敏感性試驗(yàn)提示阿米卡星和左氧氟沙星敏感，予0.9%氯化鈉溶液100 mL+頭孢美唑2.0 g ivgtt q 12 h，5%葡萄糖氯化鈉注射液250 mL+阿米卡星0.6 g ivgtt qd，聯(lián)合左氧氟沙星0.5 g qd。出院囑左氧氟沙星（可樂必妥）0.5 g qd口服。隨訪40 d，眼部無不良異常表現(xiàn)。

圖1 影像學(xué)（B超）檢查結(jié)果

2 細(xì)菌培養(yǎng)鑒定與體外藥物敏感性分析

2.1 細(xì)菌培養(yǎng)

沿角膜緣無菌切開角膜，可見大量白色膿性物質(zhì)溢出，抽取膿性物質(zhì)分別注入需氧和分枝桿菌血培養(yǎng)瓶中送檢，1 d后需氧瓶和分枝桿菌培養(yǎng)瓶同時(shí)報(bào)陽。培養(yǎng)曲線顯示：分枝桿菌培養(yǎng)瓶[圖2（a）]、需氧培養(yǎng)瓶[圖2（b）]呈典型陽性生長曲線。取適量培養(yǎng)物分別轉(zhuǎn)種哥倫比亞血瓊脂平板、巧克力平板和中國藍(lán)平板（上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司），置于5% CO2培養(yǎng)箱35 ℃培養(yǎng)，涂片2張，分別進(jìn)行革蘭染色和抗酸染色（珠海貝索公司）。革蘭染色未見細(xì)菌，涂片抗酸染色見少量抗酸染色陽性菌。培養(yǎng)1 d后，血瓊脂平板[圖2（c）]和巧克力平板均有灰白色的細(xì)小菌落[圖2（d）]生長。第5天可見單個(gè)稍大菌落，血平板上呈黃白色大小不一凸起菌落，較干燥[圖2（e）]。同時(shí)將術(shù)中脫落組織行一般細(xì)菌培養(yǎng)，接種于哥倫比亞血瓊脂平板，培養(yǎng)1 d，無細(xì)菌生長，第2天見灰白色的菌落[圖2（f）]，第5天見黃白色干燥菌落[圖2（g）]。挑取哥倫比亞血瓊脂平板上菌落行抗酸染色，可見抗酸染色陽性菌[圖2（h）]。

圖2 眼膿性物質(zhì)血培養(yǎng)和一般細(xì)菌培養(yǎng)結(jié)果

2.2 質(zhì)譜鑒定結(jié)果

用竹簽挑取血平板上純菌落，均勻涂到靶板上，滴加1 μL 70%甲酸，室溫環(huán)境放置，干燥后，再滴加1 μL基質(zhì)液。室溫干燥后，用激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜儀（德國Bruker公司）進(jìn)行分析。鑒定結(jié)果為鼻疽分枝桿菌，MALDI得分為2.054分（2.000為鑒定到種的閾值），見圖3。

2.3 測序結(jié)果

先采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增菌株的16S rRNA，引物為5'-AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3'和5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'，預(yù)期產(chǎn)物長1 500 bp。產(chǎn)物采用正-反向測序，獲得1 384 bp準(zhǔn)確的片段序列。序列做NCBI blast，結(jié)果為：Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝桿菌，一致性99.86%）、Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌，一致性99.86%）、Mycobacterium fortuitum（偶發(fā)分枝桿菌，一致性99.86%）等。由于16S rRNA區(qū)分不同種類分枝桿菌的效率不高，我們又采用聚合酶鏈反應(yīng)擴(kuò)增16S-23SrRNA間區(qū)，引物為5'-TTGTACACACCGCCCGTCA-3'和5'-TCTCGATGCCAAGGCATCCACC-3'，預(yù)期產(chǎn)物長554 bp，擴(kuò)增產(chǎn)物采用先克隆然后測序的方法，獲554 bp片段準(zhǔn)確序列。序列做NCBI blast，結(jié)果為：Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌，一致性98.7%）最高，其次為Mycobacterium dioxanotrophicus（二氧化桿菌分枝桿菌，一致性87.79%），Mycobacterium fortuitum（偶發(fā)分枝桿菌，一致性88.09%）、Mycobacterium farcinogenes（鼻疽分枝桿菌，一致性88.60%）。結(jié)合16S rRNA和16S-23S rRNA結(jié)果，確定為Mycobacterium houstonense（休斯頓分枝桿菌）。

2.4 體外藥物敏感性試驗(yàn)

參照文獻(xiàn)[5]推薦的可能敏感的抗菌藥物進(jìn)行體外藥物敏感性試驗(yàn)。用M-H血瓊脂平板（上海科瑪嘉微生物技術(shù)有限公司）進(jìn)行紙片擴(kuò)散法檢測，35 ℃培養(yǎng)2 d后，各藥物抑菌圈直徑結(jié)果分別為：阿米卡星34 mm、慶大霉素20 mm、利奈唑胺6 mm、復(fù)方磺胺甲噁唑6 mm、左氧氟沙星35 mm、亞胺培南29 mm、美羅培南19 mm、米諾環(huán)素10 mm、克林霉素6 mm、頭孢唑啉6 mm、頭孢呋辛6 mm、頭孢噻肟6 mm。參照美國臨床實(shí)驗(yàn)室標(biāo)準(zhǔn)化協(xié)會(huì)M24-A文件[6]，采用快分枝桿菌微量肉湯藥物敏感性試驗(yàn)程序及折點(diǎn)判讀結(jié)果，肉湯為7H9肉湯[艾禮生物科技（上海）有限公司]。將接種好的板條置于鋪有濕毛巾的白磁盆內(nèi)，35 ℃培養(yǎng)，隔天觀察，保持濕度，培養(yǎng)第4天觀察到菌落顯著生長，讀取結(jié)果為：阿米卡星（2 μg/mL，敏感）、頭孢西丁（64 μg/mL，中介）、環(huán)丙沙星（0.25 μg/mL，敏感）、多西環(huán)素（≥32 μg/mL，耐藥）、復(fù)方磺胺甲噁唑（≥22 μg/mL/608 μg/mL，耐藥）、妥布霉素（≥32 μg/mL，耐藥）和左氧氟沙星（0.25 μg/mL，敏感）。

3 討論

本例患者于10年前行“左眼小梁切除術(shù)”，2016年9月行閥門管植入術(shù)，2個(gè)月前左眼內(nèi)閥門管自行從眼內(nèi)脫落，入院檢查示白細(xì)胞計(jì)數(shù)為16.77×109/L ，存在感染可能，4月10日左眼眼內(nèi)容物剜除術(shù)中玻璃體液樣本培養(yǎng)出細(xì)菌，抗酸染色陽性，菌落形態(tài)似NTM，質(zhì)譜鑒定結(jié)果示：前6位為鼻疽分枝桿菌，后2位為豬分枝桿菌。

進(jìn)一步對(duì)該細(xì)菌行分子鑒定得到不同的結(jié)果：休斯頓分枝桿菌?；仡欃|(zhì)譜鑒定結(jié)果，查找MALDI Biotyper3庫，該細(xì)菌庫中沒有休斯頓分枝桿菌。豬分枝桿菌與休斯頓分枝桿菌同為偶發(fā)分枝桿菌的第3種生物變異復(fù)合體[3]，參照此質(zhì)譜鑒定結(jié)果，發(fā)現(xiàn)應(yīng)用激光解吸電離飛行時(shí)間質(zhì)譜對(duì)偶發(fā)分枝桿菌的第3種生物變異復(fù)合體這一類細(xì)菌的鑒定存在一定的局限性，質(zhì)譜鑒定是對(duì)不同的蛋白峰進(jìn)行分析，然后與庫中已有的已知蛋白峰做比對(duì)而得出的重合性的結(jié)果，在區(qū)分蛋白峰過于相似的細(xì)菌時(shí)精確性可能欠佳。測序作為鑒定的標(biāo)準(zhǔn)，采用16S-23S區(qū)間序列對(duì)該菌株進(jìn)行分辨，一致性遠(yuǎn)高于其他方法。所以對(duì)于此類分枝桿菌的鑒定，建議采用核酸測序的方法。

該病例為我國極少見的休斯頓分枝桿菌引起的眼部感染，最終經(jīng)手術(shù)摘除病變的眼球，清潔感染部位，后續(xù)沒有更大范圍的感染。類似病例的早期診斷對(duì)患者的治療極其重要，懷疑感染可能的時(shí)候，可以考慮在普通培養(yǎng)鑒定的基礎(chǔ)上增加抗酸染色涂片和分枝桿菌培養(yǎng)等項(xiàng)目。實(shí)驗(yàn)室在處理類似臨床樣本時(shí)，應(yīng)盡可能地延長培養(yǎng)時(shí)間；在革蘭染色分辨細(xì)菌有疑問的情況下，可以考慮做抗酸染色，爭取更早、更準(zhǔn)確地給予臨床結(jié)果。